原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白質、多肽、氨基酸的溶液與水合茚三酮共熱時，能產生紫色化合物，可用比色法進行測定。氨基酸與茚三酮的反應分兩個步驟。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮與另一個茚三酮分子和NH3縮合生成有色物質。
儀器藥品
721型分光光度計 臺天平
減壓蒸餾器 干燥
研缽 容量瓶
移液管 燒杯
試管架 試管
0.2mol/L檸檬酸緩沖液，pH5.0（見附表2）
80%乙醇
10mmol/L KCN：稱取0.1638gKCN溶于蒸餾水中，稀釋至250ml備用（注意：KCN劇毒！）
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：稱取1.25g重結晶茚三酮溶于25ml經重蒸餾的乙二醇甲醚中使成5%溶液。將2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀釋至125ml充分混合。然后將125mlKCN—乙二醇甲醚溶與25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置試劑瓶待用，正常情況下應為淺黃色。
標準氨基酸溶液：稱取亮氨酸20mg溶于10ml蒸餾水中，則得濃度為200μg/ml的母液。
上述所有試劑必須放在草酸保護的干燥器中，以免被空氣中的NH3所污染。
乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的處理：將5g硫酸亞鐵加在500g乙二醇甲醚中，振搖1─2小時。過濾除去硫酸亞鐵（若濾液混濁沒有關系），再在蒸餾瓶中蒸餾，收集沸點121─125℃部分，此時應為透明無色液體。KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必須隔夜才能應用。配制后1星期內穩定，若超過1星期則靈敏度降低，不宜作定量。
茚三酮重結晶：即使AR級的茚三酮，由于保管不當，常帶微紅色，配成溶液后也帶紅色，影響比色測定，故需重結晶一次方可應用。5g茚三酮溶于15ml熱蒸餾水中，加入0.25g活性炭，輕輕搖動，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分鐘后用濾紙過濾，濾液放冰箱中過液，次晨即見微黃色結晶出現，過濾，再以1ml冷水洗滌結晶，置于干燥器中干燥，最后裝入棕色試劑瓶中保存。
操作步驟
1．繪制標準曲線
取標準氨基酸母液將其稀釋成0.5、1.0、5、10、20、30、40、50μg/ml的一系列濃度。
取不同濃度的標準氨基酸溶液1ml，加0.2mol/L檸檬酸緩沖溶液(pH5.0)1ml，充分混和，然后加入1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液，充分混勻后在100℃沸水浴中加熱15分鐘，取出立即加入3ml60%乙醇稀釋之。然后冷卻，在波長570nm進行比色，讀取吸光度A570。然后繪制A570－氨基酸濃度曲線，或進行直線回歸求得相應的直線公式（參閱讀實驗86）
2．樣品的制備
稱取植物樣品3g，于研缽中加少量80%乙醇，研磨成勻漿，移于100ml容量瓶中，用乙醇將殘渣洗入瓶中，最后定容至刻度。過濾，取濾液20ml，在室溫下減壓蒸發干燥，蒸發的最后階段在表面皿上進行，得到固形物。使用前用蒸餾水溶解，配制成每ml約含樣品0.1g的稀釋液。
3．比色測定
與上述制作標準曲線的方法相同。1ml樣品（氨基酸含量大約在0.5─50μg），1ml檸檬酸緩沖液，1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液，在100℃水浴中加熱15分鐘，取出立即加入3ml60%乙醇稀釋之，冷卻后即進行比色測定，讀取A570（脯氨酸則在440nm波長測定，注意需另行繪制標準曲線）。此法對于一些小肽也可以測定。在多肽合成中常用來檢驗有無自由氨基的肽類存在。
茚三酮與氨基酸所生成的顏色在1小時內穩定，因此加乙醇稀釋后，應盡快進行測定。如果讀數超過標準曲線范圍，可再加60%乙醇稀釋之，不使A570超過0.8為宜。
4．計算
按下列公式計算植物樣品中氨基酸含(μg/ml鮮重)。
式中x為從標準曲線查得的氨基酸含量(μg/ml)。
V為20ml樣品蒸干后最后的定容體積(ml)。