氨基酸代謝標記實驗_備擇方案3長期細胞標記

長期標記意味著對細胞進行 6～32 h 持續的代謝標記。該方法特別適用于研究合成速度相對較慢的蛋白質或研究成熟的標記蛋白而不是生物合成的前體。穩定狀態的標記是長期標記的一種形式，在此過程細胞和放射性標記的氨基酸一起孵育直至放射性標記蛋白的合成和降解速率相當。如果蛋白質復合體中的亞基的初級結構已知，該方法可以對這些亞單位進行化學計量。所加入的未標記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標記的時間和細胞濃度。通常使用的培養基中含有 5％～20％ 正常的非標記甲硫氨酸含量。

細胞懸液／貼壁細胞[35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質水解產物

PBS(冷凍)37℃ 長期標記培養基

75 cm2 組織培養瓶

1. 在預熱的 37℃ 長期標記培養基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。

2.1 對于懸浮細胞：用預熱的長期標記培養基準備并洗細胞一次（見基本方案步驟 2）。

在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液中重懸 0.5 ×10⁷～2 ×10⁷ 細胞，并轉移到 75 cm² 組織培養瓶中。

2.2 對貼壁細胞： 75 cm² 組織培養瓶中生長 0.5 ×10⁷ ～2 ×10⁷ 的貼壁細胞（80% ～90%融合），在 CO₂ 培養箱中。用預熱的長期標記培養基洗細胞一次（見備擇方案 1 步驟 3）。每個 75 cm² 組織培養瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液。

3. 擰緊蓋子以防 [³⁵S] 標記的化合物揮發。在 CO₂ 培養箱內培養 16 h。

4. 洗細胞并測定摻入量（見基本方案步驟 5～7；或備擇方案 1 步驟 6～8）