RAPD（Randomly Amplified Polymorphic
DNA），意為隨機擴增多態性DNA，是利用PCR技術進行隨機擴增，把擴增的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據DNA條帶的多態性來反應模板DNA序列上的多態性。RAPD同AFLP、SSR等分子標記一樣都基于PCR擴增，只是RAPD分析只需要一個引物，其引物長度一般為10個核甘酸，其序列是隨機的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售。
單引物擴增是通過一個引物在兩條DNA互補鏈上的隨機配對來完成。由于基因組DNA的差異，使引物與模板的結合位點及這些位點之間的距離不同，使PCR擴增后的片段大小表現出多態性。在基因組DNA分子內可能存在或長或短被間隔開的顛倒重復序列，如果這些序列與引物能堿基配對，則在兩條單鏈上就會出現該引物的結合位點，結合位點的數量取決于這種重復序列的多少。不同DNA分子中這種顛倒重復序列間隔的長短不同，擴增條帶的大小就不同，即表現出多態性。
10堿基引物理論上有 410
種組合，不同引物檢測的模板序列不同，用足夠多的引物可覆蓋基因組全序列，檢測位點多，可以在完全不知道分子生物學背景的情況下對基因組進行分析，是研究植物系譜關系、起源與進化、遺傳多樣性及分子標記輔助育種的簡單易行的方法；此外，外源基因轉化后，轉基因植株與非轉基因植株相比，外源基因插入的部位導致基因組DNA序列不同或重排，當引物適宜時，擴增條帶的長短就會不同，RAPD技術可以檢測出對照植株和轉化植株PCR產物帶型的區別。
由于隨機引物短，與模板結合的退火溫度低，易出現堿基錯配，因此在實驗中要嚴格操作程序及條件，使RAPD分析的結果較為穩定。因其費用較低，方便易行，模板DNA用量少，不需要同位素，安全性好，繼RFLP之后得到廣泛應用；且操作上比AFLP、SSR等分子標記較為簡便易行，因此，多數種類的栽培植物在資源多樣性、分子標記等方面都有大量RAPD的研究報道。
本實驗目的是學習RAPD技術的原理，掌握RAPD的操作及分析方法。
一、試材及用具
試材:植物基因組DNA。
用具:PCR儀，1μL、10μL、20μL、100μL微量移液器及吸管，PCR管（200μL或500μL）及管架，1.5 mL離心管及管架，離心機，記號筆，磁力攪拌器，高壓滅菌鍋，電泳儀，電泳槽，電爐，三角瓶，紫外透射儀、凝膠成像系統。
藥品:10 核苷隨機引物、dNTP、瓊脂糖、耐熱DNA聚合酶［TagDNA聚合酶，與酶一起的還有兩種藥品，分別是10× PCR
Buffer（500 mmol/LKCL、pH 9.0的100 mmol/L Tris-Cl、1.0%Tritonx?100）和25
mmol/L MgCl2。
其他的藥品和緩沖液有:
10 mg/mL的溴化乙錠（EB）貯存液:在100 mL蒸餾水中加入1g EB，在磁力攪拌器上攪拌數h，使其完全溶解，轉至棕色瓶中避光4 ℃保存。EB是強誘變劑，稱量時要戴手套和口罩。一旦接觸了EB，立即用大量水沖洗。
1× TAE電泳緩沖液:50× TAE濃縮貯存液含Tris堿242g；冰醋酸57.1 mL；pH 8.0的0.5 moL/L EDTA 100 mL；加600 mL蒸餾水，在磁力攪拌器上攪拌，最后加蒸餾水定容至1000 mL。
6× 凝膠加樣緩沖液:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。
二、方法步驟
（一） 高壓滅菌
把所用的吸頭、PCR管、離心管等用具在高壓滅菌鍋中121℃（約1.1 kg/cm2 ）高壓滅菌30 min。
（二）PCR反應物的混合
所用反應體系為:25μL反應體系中，10× PCR Buffer2.5 μL，2.0 mmol/L MgCl2 ，0.2 mmol/L
dNTP,，各引物0.1 μmol/L，TaqDNA酶1.5 U，各品種DNA模板濃度為20~50 ng，加重蒸水（dd H2O）補充到25
μL。
按照該反應體系，先在1.5 mL離心管中冰浴混合除模板以外的各成分，充分混勻，稍離心，分裝到各PCR管中，然后把各品種的DNA模板分別加入到各管中，蓋嚴管蓋，在管外壁上做好標記，稍離心，放入PCR儀中。
（三）PCR擴增
PCR反應在DNA擴增儀中進行，所用程序為，94℃預變性4 min，94℃變性30 s，36℃退火30 s，72℃2 min，44個循環后72℃延伸10 min。反應結束后, 取出管子，置4℃冰箱中保存。
注意問題。在進行大量擴增前需對該物種確定擴增的優化體系，尤其是沒有文獻報道過的植物種類，如Mg2+ 適宜的濃度，TaqDNA酶的用量，退火溫度等，各因子設計出梯度，通過檢測擴增帶的穩定性和亮度來確定優化的反應體系。
（四）瓊脂糖電泳檢測擴增產物
制膠。根據PCR反應管的數量和電泳槽的大小估算瓊脂糖膠的體積，稱1.6~2.0
%的瓊脂糖溶解于1×TAE電泳緩沖液中，在電爐上加熱使瓊脂糖充分溶解，待溶液溫度降到60℃，加入EB，使EB的終濃度為1
μg/mL，搖勻，倒入帶有梳子的膠床中，避免產生氣泡，室溫下約30 min膠自然凝固。
點樣。取出擴增DNA的管子，取7 μL擴增產物與2μL加樣緩沖液混合；輕輕拔出瓊脂糖膠上的梳子，把瓊脂糖膠放入電泳槽中，倒入1×
TAE電泳緩沖液使液面高出膠面約1 cm；移液器插上10 μL吸管吸入DNA樣品后，尖端插入加樣孔底部，緩慢把DNA樣品加入到點樣孔中。
電泳。加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源，黑線連陰極，紅線連陽極，打開電源，正確設定電壓及時間，時間的選擇取決于膠的長度和電壓大小。一般用不高于5v/cm的電壓，電泳約2 h，待溴酚藍離膠邊約1~1.5 cm時停止電泳。
檢測和照相。小心取出凝膠，置于紫外透射儀上，紫外燈下檢測擴增片段的有無及分離情況，在凝膠成像儀上照相，圖片保存于計算機中，待統計分析。
注意問題。兩電極間電壓不應超過5v/cm，電壓越高，遷移越快，但分離效果相對較差；擴增帶如果不是細亮清晰而呈形狀模糊或條帶粗亮相連，可能是DNA加樣量太多或電壓過高或瓊脂糖濃度偏低等，在重新電泳時做適當的調整。
（五）RAPD條帶分析
把RAPD每個反應重復2次。以兩次重復中穩定出現的亮帶作為統計對象，有電泳帶記為1，無電泳帶記為0，錄入計算機Excel表格中。利用STATISTIC軟件，采用UPGMA方法（非加權類平均法:Unweighted
Pair Group Method using Arithmetric
Averages）對所用品種或材料進行聚類分析。S為兩樣品間的遺傳相似度，D為遺傳距離，S=2Nxy/(Nx+Ny)，D=1-S，Nxy為本兩個樣品共享的RAPD標記數，Nx、Ny分別為X樣品和Y樣品分別具有的RAPD標記數。
注意問題。對電泳結果的判讀同PCR條件是否優化及引物數量是否足夠等一樣，會影響RAPD
結果的可信度。對電泳結果的判讀主要是一些弱帶的取舍問題，弱帶取舍主要看其重復出現的幾率，可進行重復實驗；也可在難取舍的弱帶位置上出現的電泳條帶都不統計，這樣可能丟失了一些多態性信息位點，對研究材料的系譜關系等影響不大，但當研究分子標記或構建基因連鎖圖譜時就不可取。