1）組織及體液中梅毒螺旋體檢驗從早期皮膚黏膜的皮疹和破潰處取材作涂片，用暗視野顯微鏡觀察可見梅毒螺旋體。
2）梅毒血清試驗 一般對疑似梅毒患者均需作血清試驗，可先做非螺旋體抗原試驗，必要時再做梅毒螺旋體抗原試驗。常用的非梅毒螺旋體抗原血清試驗有血清不加熱的反應素玻片試驗（USR）、性病研究實驗室玻片試驗（VDRL）和快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）。常用的梅毒螺旋體抗原血清試驗有熒光螺旋體抗血清試驗（FTA—ABS）和梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA）。
3）腦脊液檢查 包括腦脊液細胞計數、蛋白測定、梅毒血清試驗（常用VDRL試驗）和膠體金試驗，一般用于晚期病人且懷疑有神經梅毒者。
此外，對于皮膚黏膜損害也可應用活體組織病理切片檢查，從病理上進行診斷。