核磁共振波譜法在食品分析中的應用

一、概述

核磁共振（Nuclear  Magnetic  Resonance，NMR）波譜是一種基于特定原子核在外磁場中吸收了與其裂分能級間能量差相對應的射頻場能量而產生共振現象的分析方法。核磁共振波譜通過化學位移值、譜峰多重性、偶合常數值、譜峰相對強度和在各種二維譜及多維譜中呈現的相關峰，提供分子中原子的連接方式、空間的相對取向等定性的結構信息。

在一個分子中，各個質子的化學環境有所不同，或多或少受到周邊原子或原子團的屏蔽效應影響，因此它們的共振頻率也不同，從而導致在核磁共振波譜上各個質子的吸收峰出現在不同的位置上。但這種差異并不大，難以精確測量其絕對值，因此采用一個信號的位置與另一參照物信號的偏離程度表示，稱為化學位移（Chemical Shift），即：某一物質吸收峰的頻率與標準質子吸收峰頻率之間的差異，是一個無量綱的相對值，常用符號“δ”表示，單位為PPm。也可用氛代溶劑中殘留的質子信號作為化學位移參考值。在實際應用中，常用四甲基硅烷（TMS）作為參照物。

δ=(V_sample—V_TMS)/V_TMS×10⁶

核磁共振定量分析以結構分析為基礎，在進行定量分析之前，首先對化合物的分子結構進行鑒定，再利用分子特定基團的質子數與相應譜峰的峰面積之間的關系進行定量測定。核磁共振波譜是一專屬性較好但靈敏度較低的分析技術。低靈敏度的主要原因是基態和激發態的能量差非常小，通常每十萬個粒子中兩個能級間只差幾個粒子（當外磁場強度約為ZT時）。磁性原子核，如1H和13C在恒定磁場中，只和特定頻率的射頻場作用。共振頻率、原子核吸收的能量以及信號強度與磁場強度成正比。例如，在場強為21特斯拉（T）的磁場中，質子的共振頻率為900MHz。盡管其他磁性核在此場強下擁有不同的共振頻率，但人們通常把21特斯拉和900MHz頻率進行直接對應。以1H核為研究對象所獲得的譜圖稱為氫核磁共振波譜圖；以13C核為研究對象所獲得的譜圖稱為碳核磁共振波譜圖。

核磁共振譜可提供四個重要參數：化學位移值、譜峰多重性、偶合常數值和譜峰相對強度。核磁共振信號的另一個特征是它的強度。在合適的實驗條件下，譜峰面積或強度正比于引起此信號的質子數，因此可用于測定同一樣品中不同質子或其他核的相對比例，以及在加入內標后進行核磁共振定量分析。

二、核磁共振譜儀

常見的有兩類核磁共振波譜儀：經典的連續波（CW）波譜儀和現代的脈沖傅里葉變換（PFT）波譜儀，絕大多數為后者。組成主要包含超導磁體、射頻脈沖發射系統、核磁信號接收系統和用于數據采集、儲存、處理以及譜儀控制的計算機系統。

三、定性和定量分析

1.定性分析

核磁共振波譜是一個非常有用的結構解析工具，化學位移提供原子核環境信息，譜峰多重性提供相鄰基團情況以及立體化學信息，偶合常數值大小可用于確定基團的取代情況，譜峰強度（或積分面積）可確定基團中質子的個數等。一些特定技術，如雙共振實驗、化學交換、使用位移試劑、各種二維譜等，可用于簡化復雜圖譜、確定特征基團以及確定偶合關系等。

對于結構簡單的樣品可直接通過氫譜的化學位移值、偶合情況（偶合裂分的峰數及偶合常數）及每組信號的質子數確定，或通過與文獻值（圖譜）比較確定樣品的結構以及是否存在雜質等。與文獻值（圖譜）比較時，需要溶劑種類、樣品濃度、化學位移參照物、測定溫度等實驗條件的影響。對于結構復雜或結構未知的樣品，通常需要結合其他分析手段，如質譜等確定其結構。

2.定量分析

與其他核相比，1H核磁共振波譜更適用于定量分析。在合適的實驗條件下，兩個信號的積分面積（或強度）正比于產生這些信號的質子數：

A1/A2=N1/N2

式中：A1、A2—相應信號的積分面積（或強度）；

N1、N2—相應信號的總質子數。

如果兩個信號來源于同一分子中不同的官能團，上式可簡化為

A1/A2=n1/n2

式中：n1、n2—相應官能團中的質子數。

如果兩個信號來源于不同的化合物，則

A1/A2=n1m1/n2m2=(n1W1/M1)/(n2W2/M2)

式中：ml、m2—化合物1和化合物2的分子個數；

W1、W2—其質量；

M1、M2—其分子量。

由后兩式可知，核磁共振波譜定量分析可采用絕對定量和相對定量兩種模式。

在絕對定量模式下，將已精密稱定重量的樣品和內標混合配制溶液，測定，通過比較樣品特征峰的面積與內標峰的面積計算樣品的含量（純度）。內標應滿足如下要求：有合適的特征參考峰，最好是適宜寬度的單峰；內標物的特征參考峰與樣品峰分離；能溶于分析溶劑中；其質子是等權重的；內標物的分子量與特征參考峰質子數之比合理；不與待測樣品相互作用等。常用的內標物有：1,2,4,5一四氯苯、1,4一二硝基苯、對苯二酚、對苯二酸、苯甲酸芐酯、順丁烯二酸等。內標的選擇依據樣品性質而定。

相對定量模式主要用于測定樣品中雜質的相對含量（或混合物中各成分相對含量），由上式計算。

供試品溶液制備：分別取供試品和內標物適量，精密稱定，置同一具塞玻璃離心管中，精密加入溶劑適量，振搖使完全溶解，加化學位移參照物適量，振搖使溶解，搖勻。

測定方法：將適量供試品溶液轉移至核磁管中，正確設置儀器參數，調整核磁管轉速使旋轉邊峰不干擾待測信號，記錄圖譜。用積分法分別測定各品種項下規定的特征峰面積及內標峰面積，重復測定不少于5次，取平均值，由下式計算供試品的量Ws:

Ws＝Wr×(As/Ar)×（Es/Er)

式中：Wr—內標物的重量；

As和Ar—供試品特征峰和內標峰的平均峰面積；

Es和Er—供試品和內標物的質子當量重量（質量）（以分子量除以特征峰的質子數計算得到）。

由下式計算供試品中各組分的摩爾百分比：

(A1/n1）／［(A1/n1）＋(A2/n2）］×100

式中：A1、A2—各品種項下所規定的各特征基團共振峰的平均峰面積；

n1、n2—各特征基團的質子數。

4.核磁共振波譜法在食品分析中的應用

NMR技術可以分析食品中水分含量、分布和存在狀態的差異及對食品品質、加工特性和穩定性的影響；是取代油脂質量控制實驗室中采用固體脂肪指數(SFI）分析方法唯一可行的、有潛在用途的儀器分析方法，并且已經形成了國際標準；可用于研究食品玻璃態轉變；可解析碳水化合物的結構，包括糖殘基數目、組成單糖種類、端基構型、糖基連接方式和序列以及取代基團的連接位置；研究淀粉的顆粒結構、糊化凝沉的特性和動力學、分子遷移、變性淀粉取代度測定等；NMR是能夠在原子分辨率下測定溶液中生物大分子三維結構的唯一方法，在研究蛋白質和氨基酸的結構、動力學以及蛋白質相互作用等方面發揮著重要作用，利用核磁譜研究蛋白質，已經成為結構生物學領域的一項重要技術手段。依據不同食品的特定參考標準，在食品品質鑒定方面也得到有效應用，包括鑒別果蔬和谷物在生長過程中及采摘后的內部品質、成熟度、內部缺陷等，以及肉類、酒類、油脂類食品的原產地和品質優劣等。