實驗概要
目前雞球蟲不能在離體的情況下長期保持其毒性和活力,每隔一段時間需要以雞作為實驗動物進行球蟲的傳代、分離、收集和保存。此方法為柔嫩艾美耳球蟲的日常傳代和收集方法。
實驗步驟
1. 將保存在2.5%重鉻酸鉀中的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊懸液離心10min(3000r/min),棄去上清,再用PBS重懸沉淀,重復洗滌2次,除去重鉻酸鉀;
2. 經口接種給飼養于無球蟲環境下7日齡的小雞,攻蟲數量為孢子化卵囊5×104個/只,感染后第8天撲殺所有攻毒的雞只,解剖收取盲腸;
3. 收集的盲腸經過勻漿機勻漿,加入清水3000rpm離心15min,棄上清,用適當PBS重懸;
4. 加入胃蛋白酶(2毫克/毫升),調整PH為2.0,39℃處理1小時,過200目篩子;
5. 收集液體,3000rpm離心10分鐘,棄去上清,沉淀用飽和食鹽水漂浮,3000rpm離心15min,收集上清;
6. 上清中加入至少三倍體積清水,降低鹽水濃度,再次3000rpm離心15min,棄上清;
7. 加入有效氯含量7%-10%的NaClO冰浴消化5min左右,加入3倍左右體積的清水稀釋,3000rpm離心15min,收集沉淀;
8. 沉淀用2.5%重鉻酸鉀溶液吹打均勻,29℃通風孢子化,待孢子化率達到90%,將此卵囊收起貼上標簽,4℃儲存(最好儲存少于半年)。