桿狀病毒儲液制備實驗——從單層培養中制備

單層培養的 Sf 9 細胞待接種的桿狀病毒（野生型的或重組）

含10％胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH

150 mm 培養瓶27℃ 培養箱倒置顯微鏡帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃GPR離心機帶螺口蓋的凍存管液氮罐500 ml 旋轉細胞培養瓶多轉瓶的攬拌臺

1. 以 1.8×10⁷ Sf 9 細胞/瓶的密度，將細胞接種于兩個 150 mm 培養瓶，在含 10％ 胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH 中培養。27℃ 溫育 1 h 使細胞貼壁。

2. 當細胞貼壁時，取適量的待接種的桿狀病毒于 30 ml 新鮮的含 10％ 胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH，使感染復數（MOI）為 0.1～1。細胞貼壁后，移去培養液，每個培養瓶中各加入 15 ml 含有病毒的培養液。

MOI 以 pfu/細胞來表示。感染給定數目細胞的病毒接種物的體積=MOI （pfu/細胞）× [細胞數/毒種儲液的滴度（pfu/ml）]

3. 27℃ 溫育數日。每天在倒置顯微鏡下觀察感染跡象，如細胞病變效應（如果使用包含體陰性重組病毒），或包含體（如果使用野生型桿狀病毒或包含體陽性重組病毒）。包含體具高折光性，帶微黃的綠色晶體狀，在光學顯微鏡下很容易發現。

4. 當大多數細胞含有包含體或顯示出細胞病變效應時（通常在感染后 4～5 天），將培養液移入滅菌試管中，4℃，1000 g 離心 10 min， 將上清移至一新的滅菌試管。分別吸取 1 ml 上清移至幾個螺口凍存管中，置于液氮罐長期保存。將剩余的病毒置暗處 4℃ 短期保存。該步驟應可得到約 40 ml （1～3）× 10⁸ pfu/ml 的病毒儲液。

如果待擴增的病毒源自單個噬斑（見病毒儲液滴度測定實驗），將瓊脂糖塊置于一含 0.5 ml TNM-FH/10％ FBS 的小離心管中 4℃ 旋轉過夜。再按步驟 1.1 感染 Sf 9 細胞：在 100 mm 培養皿中，用 2 × 10⁶ 細胞，27℃ 溫育 1 h。加入 8 ml TNM-FH /10％ FBS 培養液，27℃ 溫育 4 天。按步驟 1.4 收獲病毒。噬斑法確定滴度（見病毒儲液滴度測定實驗）， 重復步驟 1.1～1.3，擴增病毒以獲得高滴度的儲液。如果昆蟲細胞已適應無血清培養，病毒儲液也可用無血清培養的昆蟲細胞制備（見昆蟲細胞保存培養實驗）。用無血清培養液代替 TNM-FH/10％ FBS，按步驟 1.1～1.4 進行即可。