朱正江：軟件平臺自主創新破冰代謝組學研究難點

　　近期，中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心朱正江研究員、劉南研究員課題組合作的最新學術成果發表在《自然·通訊》期刊（Nature Communications），應用基于穩定同位素標記的非靶向代謝流組學技術MetTracer，在系統層面上揭示了果蠅衰老過程中發生的代謝穩態變化，其中MetTracer技術已申請國家發明ZL。近日，分析測試百科采訪到朱正江研究員，他分享了代謝組學面臨的挑戰和應對之道，詳解了質譜技術在代謝組學研究和臨床應用中的特點，展望了未來代謝組學和質譜技術的發展趨勢。

中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心 朱正江研究員

基于質譜技術開發代謝組學技術

　　中科院生物與化學交叉研究中心（以下簡稱“交叉中心”）是依托中國科學院上海有機化學研究所于2012年成立的一個跨學科綜合研究中心，以人類健康前沿研究領域中的神經系統疾病，如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥等與衰老相關的神經退行性疾病以及神經損傷和修復為核心，發展和運用最前沿的生物與化學技術手段，對人類神經系統病變特別是神經退行性疾病中共性和關鍵性的科學問題開展研究。

　　朱正江研究員是交叉中心質譜與代謝組學實驗室的課題組長，主要工作圍繞以質譜技術為核心的代謝組學研究。“代謝物的測量可以用核磁、質譜等技術，而我們實驗室主要是用質譜技術來發展代謝組學技術。”朱正江說。代謝組學主要分析小分子代謝物，比如體內常見的氨基酸、脂類等。課題組約60%的工作聚焦于代謝組學技術開發研究，此外還有2個應用方向，一個是代謝生物學方向，主要聚焦衰老過程中的代謝物變化和代謝調控機制研究，以及衰老相關疾病（如阿爾茲海默癥，帕金森癥等）病程中的代謝變化；另一個是代謝組學的臨床應用方向，通過和臨床醫生合作，對腫瘤、心血管疾病、阿爾茲海默癥等疾病的臨床樣本等進行臨床代謝組學研究。

　　朱正江介紹說：“我們最重要的力量是圍繞代謝組學的技術開發，聚焦于通過質譜技術進行高效率、高覆蓋的代謝物鑒定。”談到代謝組與其它組學的不同時朱正江表示：蛋白質組學也用質譜進行分析研究，主要面臨定量準確性、數據重現性等問題，但基本不會遇到鑒定不準的問題；而代謝組學研究中的最大挑戰是：如何將質譜信號轉化為代謝物的化學結構，即代謝物化學結構鑒定問題。

　　通常來說，小分子的化學結構鑒定一般使用核磁技術。但在實際研究工作中，核磁無法應對微量樣本（10-100μL）和復雜生物樣本中的大量代謝物進行同時高覆蓋、高準確的結構鑒定。而質譜具有高靈敏度，適用于復雜樣本、微量樣本的分析，并可在短時間內采集成千上萬個質譜信號。但如何將成質譜信號轉化成代謝物的化學結構，就成為基于質譜的代謝組學技術的難點。

　　朱正江課題組的研究聚焦于如何從質譜信號中解析代謝物的結構。其中有兩個策略，一個是用計算的方法，通過自行搭建數據庫并從數據庫中總結規律，開發了基于代謝反應網絡的代謝物結構鑒定算法MetDNA。MetDNA是代謝組學研究的重大突破之一，最重要特色是利用已知、少量的代謝物的信息去鑒定大量、未知的代謝物。另一個策略是用離子淌度質譜方法，通過引入淌度分離過程中的碰撞截面積（CCS）值來輔助代謝物的鑒定，課題組已開發了很多離子淌度質譜的基礎性的數據庫（如AllCCS）、數據處理軟件（如Met4DX、 Lipid4DAnalyzer）等。

代謝組學的兩大研究挑戰

　　提及代謝組學的研究挑戰，朱正江表示主要有兩大方面：高準確性、高覆蓋度的代謝物化學結構鑒定和功能性代謝物的發現。

　　代謝物化學結構鑒定包括已知代謝物和全新未知代謝物化學結構鑒定。無論是面對常規樣本、微量樣本、或單細胞樣本分析，都存在代謝物化學結構的高準確、高覆蓋鑒定的挑戰。當前單細胞測序已很成熟，單細胞蛋白質組學也發展得風生水起，它們均沒有遇到基因識別、蛋白質鑒定問題。但單細胞水平的代謝物，因為含量極低、信號不夠豐富，通常都不能進行MS/MS譜圖數據采集，因此不一定能夠準確鑒定其中代謝物的化學結構。此外，全新未知代謝物的鑒定也是另外一個重大挑戰。現在已知的代謝物有20萬種，近一兩年不斷發現有新的功能性代謝物。因此，代謝物化學結構鑒定既包括已知代謝物，也包含未知代謝物的結構鑒定。從常規分析到高精尖的單細胞分析都面臨同樣的問題，如何更高覆蓋地、更準確地鑒定小分子代謝物的化學結構是代謝組學的難點。

　　隨著未來技術發展越來越成熟，如何發現功能性的代謝物是新的挑戰。當前代謝組的很多研究者背景偏分析化學，目標是測定生物樣本中，如果血漿、細胞和組織樣本，盡可能多的代謝物。而真正的生命科學和疾病研究，并不關注樣本中所有的代謝物，他們更希望獲知哪個代謝物發揮了關鍵作用。如同發現重要的基因或蛋白靶點一樣，研究者希望發現重要的、有關鍵調控作用的代謝物，可稱之為功能代謝組學/功能性代謝物的發現。在疾病發生和發展過程中起到促進、抑制作用，或者成為疾病診斷標志物，或預示疾病發生發展或者預后的代謝物都統稱為功能性代謝物。朱正江強調：“生命科學研究者們需要知道在生命過程中哪些代謝物起到了決定性作用，不是僅僅發現代謝物，而是要發現哪個代謝物更重要，這需要達到更高的層次，既是難點也是未來發展的方向。”

MetDNA+MetTracer破冰研究痛點

　　今年6月，朱正江研究員和劉南研究員課題組在《自然· 通訊》 （Nature Communications）雜志在線發表了題為“Global Stable-isotope Tracing Metabolomics Reveals System-wide Metabolic Alternations in Aging Drosophila”的研究論文 (Nature Communications, 2022, 13: 3518) ，結合了前期發展的大規模代謝物結構鑒定技術MetDNA和穩定同位素標記代謝物檢測技術，發展了基于穩定同位素標記的非靶向代謝流組學技術MetTracer，從而在以果蠅為例的動物模型中揭示了果蠅衰老過程中發生的代謝穩態變化。

　　朱正江表示：“這項研究成果有2個重要貢獻。首先是發展了非靶向代謝流組學技術MetTracer（已申請ZL）；其次是在衰老過程中，發現了一個衰老代謝的調控通路。”

　　MetDNA：缺乏標準品MS/MS時進行數千種代謝物鑒定

　　早在2019年，朱正江課題組就在《自然· 通訊》（Nature Communications）雜志發表了一種基于代謝反應網絡的代謝物結構鑒定算法MetDNA，創新性地克服了代謝物結構鑒定對于代謝物標準MS/MS譜圖庫的依賴，能夠在多種生物樣本中鑒定出超過2000種代謝物的結構，相比傳統方法提高了近10倍，極大地提高了代謝物結構鑒定的效率和準確度。

MetDNA的工作原理和基本流程

　　朱正江強調：“這是我們在技術上的一個重要進展，MetDNA技術可利用已知、少量的代謝物去鑒定大量、未知的代謝物。”

　　MetDNA的基本原理是：在細胞環境中，一種代謝物可以被催化成另一種代謝物產物。因此將底物代謝物與其相似化學結構的產物代謝物定義為一對反應對（RP）。在串聯質譜中，代謝物的碎裂模式由其化學結構決定，由于結構的相似性，反應配對的兩種代謝物傾向于具有相似的MS2譜。因此，原則上MetDNA可以使用反應對中的一個代謝物來注釋另一個未知代謝物，而不一定通過標準品譜圖數據庫中現有的MS2譜圖來注釋。MetDNA先通過一個小的二級質譜數據庫對代謝物進行鑒定，將鑒定到的代謝物作為種子，然后利用這些種子代謝物的MS2譜去注釋與它成對反應的相鄰代謝物，循序遞進，進行遞歸的注釋分析，重復應用該策略可逐步擴展注釋代謝物。數據顯示，在一個實驗中，MetDNA顯著增加了代謝物的注釋數量，從傳統分析的不到100種代謝物增加到超過2000種代謝物。MetDNA還包括一個自我檢查的打分系統，可以減少冗余和不確定性。

　　因此，MetDNA能大規模地提高小分子代謝物結構鑒定的數量和覆蓋度，即使是基于不同的質譜平臺、不同的數據采集模式（DDA/DIA）采集的各種生物樣本的質譜數據，都能在一次實驗中累積注釋到大約2000個代謝物結果。最近朱正江課題組對MetDNA技術進行了升級，最新的MetDNA2 開發了多層代謝網絡技術用于提升對于未知代謝物鑒定的能力，同時也通過全局質譜峰關聯網絡提升代謝物鑒定的準確度。MetDNA數據分析平臺（http://metdna.zhulab.cn/）為代謝組學研究者提供了免費的數據分析服務，已為世界上40多個國家和地區的1600余位用戶完成了超過1.3萬個代謝組學項目的數據處理，具有廣泛的國際影響力和認可度。

　　MetTracer：對整個代謝組進行全面的代謝流動態分析

　　目前基于質譜的非靶向代謝組學（Global metabolomics）研究大多是“靜態分析”，即在某個時間點采樣分析，難以測定生物體內代謝物合成和降解等動態變化規律。代謝流分析技術通常采用穩定同位素示蹤（Stable-isotope tracing）實驗來追蹤穩定同位素在代謝物中的流向，通過測定代謝網絡中代謝物的同位素分布，來計算代謝物合成和降解等動態變化規律。但是，當前代謝流分析大多只靶向分析特定的代謝通路，如糖酵解、三羧酸循環、氨基酸代謝、脂肪酸代謝等，難以全面地對整個代謝組的動態變化進行大范圍檢測和解析，且限制了發現新的代謝通路和代謝反應。

　　那么，如何對生命體的整個代謝組進行全面的代謝流動態分析呢？

　　首先，采用穩定同位素標記時，一般用¹³C或¹⁵N這樣的穩定同位素標記活的細胞進行代謝，將代謝物中的¹²C取代成¹³C形成同素異形體，并通過質譜進行分析。

　　朱正江解釋道：“該技術難點是，本來進行一個代謝物鑒定就很困難，而每個代謝物經過同位素標記后會得到數個標記之后的同素異形體(isotopologue)，一條通路可能會出現二十多個代謝物。一旦放大工作量，需要對上千個標記同素異形體(isotopologue)進行追蹤，而且樣品量達到上百個時，人工鑒定和數據分析難以完成，人工判斷的失誤率也會極大地增大。”

　　針對上述技術難點，需要開發出能夠正確并高覆蓋地識別同素異形體的技術。因此，課題組基于MetDNA策略，先鑒定出未標記生物樣本中的所有代謝物，將其作為模板推導出可能產生的同素異形體。朱正江比喻道：“將目標代謝物的色譜質譜峰形作為模板，靶向提取代謝物，就類似于用畫像在茫茫人海中去找一個人。在根據模板尋找代謝物時用多種實驗室前期開發的算法進行打分、包括m/z準確度，保留時間準確度，EIC峰型相似度等，就類似于人臉識別的打分。”這種策略能夠在一次實驗中自動去提取出成千上萬個代謝物的同素異形體。

　　該突破性的技術具有以下特點：1，追蹤覆蓋范圍高，能夠對上千個代謝物的上萬個同素異形體同時進行穩定同位素標記的追蹤；2，對穩定同位素標記代謝物的定量準確性高且可重復性好；3，大規模數據分析的假陽性低。

基于穩定同位素標記的代謝流組學技術MetTracer（圖片來源：Nature Communications）

　　發現衰老相關重要代謝通路

　　果蠅是衰老研究中常用的模式動物。在開發MetTracer技術后，課題組通過¹³C標記方法喂養果蠅，然后解剖果蠅的腦組織和肌肉組織進行非靶向代謝流組學的分析，在腦組織和肌肉組織中分別追蹤到390個和597個標記的代謝物。通過多個時間點標記程度的聚類分析表征了代謝物可以根據標記速率分為高、中、低標記速率三類，分別富集于糖相關代謝、氨基酸相關代謝和嘌呤代謝脂肪酸合成等代謝通路。最后，通過對年輕果蠅和衰老果蠅進行了代謝穩態變化的系統性分析，找到了一條重要的代謝通路。課題組在研究中發現，果蠅衰老過程中存在糖酵解代謝減弱、絲氨酸代謝增強的代謝轉變。

果蠅衰老過程中的代謝穩態變化（圖片來源：Nature Communications）

　　朱正江介紹說：“我們文章發表的同時，另一篇發表在Cell Metabolism的文章，在研究老年癡呆癥的人群隊列樣本中，也發現了絲氨酸代謝的上調是老年癡呆癥的一個標志，同時跟病人的認知能力成負相關。這是兩個完全獨立的實驗但殊途同歸，以人和果蠅作為不同實驗對象。我們在果蠅活體上發現的隨衰老增強的絲氨酸代謝，同人群隊列樣本中發現的衰老所引起的老年癡呆癥代謝通路是相互吻合的。這也充分證明我們這項技術能夠發現新的跟衰老相關的代謝調控的通路。”

　　突破邊界：發現新未知代謝物和新代謝通路

　　MetTracer 的技術特點是利用MetDNA鑒定出來的代謝物作為模板，通過靶向提取的策略實現高靈敏度、高覆蓋性、高準確性、低假陽性地代謝物識別。最大的優勢是通過同位素標記將實驗數據分析變成傻瓜式操作，無需人工提取和辨別。而且把以前局限于少數幾條通路的實驗擴大到整個代謝組。

　　除了能夠識別已知代謝物是否被標記，通過質譜信號MetTracer還能發現新的代謝物。課題組還在常見的生物樣本里發現了若干個全新的未知代謝物。以前的質譜信號很難判斷代謝物的來源，因為樣本制備的過程中的污染也會產生質譜信號；但通過同位素標記后，只有真的活性物質才會代謝產生新的信號。以前通過MetDNA分析已知的質譜信號，現在將這項技術拓展后還能在被標記后做未知代謝物的鑒定。所以它能夠很好地發現生命體所產生的新的未知代謝物。

　　此外，以往的代謝物鑒定是根據信號測定其含量，但無法知道兩個代謝物之間有沒有關系，需要先分別鑒定出兩個代謝物以后才能判定。當應用MetTracer后，如果有兩個代謝物的同素異形體很相像，則表示它們是共同代謝的，用該方式可能發現新的代謝通路或者新的代謝反應。

　　朱正江展望說：“未來，MetTracer還有2個重要用途，一是發現新的未知代謝物，二是發現新的代謝反應以及相應的代謝通路。MetTracer突破了此前非靶向非標記代謝組學技術的邊界。”

　　平臺不斷更新

　　MetDNA可以支持多種儀器平臺，解決了代謝物鑒定的痛點問題。當前有很多軟件幫助進行原始數據處理，但一站式鑒定的軟件相對很少。有很多用戶將數據上傳，然后自動處理后就可以獲得鑒定的結果。

　　MetDNA已更新到第二版本，從鑒定已知代謝物發展到鑒定未知代謝物。下一個版本將支持從頭推導全新的結構；并增加數據庫，增加保留時間，色譜柱考慮反相或親水HILIC色譜柱；可解析質譜干擾信號，考慮中性丟失、離子源裂解等多種情況下的干擾；提供更多功能來解析質譜信號，包括一些下游數據的通路分析，統計分析方案，不斷提升用戶體驗。

　　朱正江強調：“在技術方面，我們未來的方向將聚焦于如何從質譜信號中解析已知的代謝物化學結構和越來越多的未知代謝物，通過發展一些基于深度學習的人工智能算法，借助穩定同位素標記技術，從質譜信號去推導化學結構。第二個重要方向不僅限于代謝物結構的鑒定，還將更多關注功能性代謝物，尤其是衰老、神經退行性疾病、臨床診斷過程中，用該技術發現一些新的重要的功能性代謝物。”

工欲善其事 必先利其器

　　代謝組學分析的工作和質譜儀密不可分。朱正江表示：“在生命科學領域中，我們應用較多的是賽默飛Orbitrap Exploris 480質譜儀，一方面用于常規代謝組學研究分析，另一方面利用其長程穩定性的特點進行臨床代謝組學研究。”

朱正江實驗室的賽默飛Orbitrap Exploris 480質譜儀

　　談到該儀器的特點朱正江表示：“首先，在常規代謝組學研究首先需要使用幾千個標準品建立代謝物數據庫。賽默飛Orbitrap Exploris 480質譜儀不僅能在不同能級的情況下建庫，還能在不同的LC條件下對每個代謝物做保留時間建庫。

　　建庫之后，以這些數據作為起始數據去訓練MetDNA，使其通過已知代謝物去推導未知代謝物。MetDNA訓練后的數據庫，再用來做MetTracer實驗。Orbitrap Exploris 480質譜儀的優點是分辨率高，特別是在穩定同位素標記的代謝物檢測方面，超高分辨率更有利于清晰地分辨同位素，對我們的實驗有很大的幫助。”

　　在臨床樣本應用方面，一次實驗通常采集成百上千個樣本，儀器需要連續運行一個星期或者更長時間，質譜儀器的長程穩定性、耐污染性以及重現性是考量的首要標準。

　　朱正江強調：“由于賽默飛Orbitrap Exploris 480質譜儀良好的長程穩定性，給我們提供了無與倫比的體驗，在很長的運行時間里保持很好的穩定性，特別是對小分子的抗污染性很強，不用擔心需要運行一個星期或者更長時間的實驗。”

　　朱正江回顧說：“代謝組學業內使用傳統高分辨質譜儀比較多，在小樣本規模的生物學研究時其穩定性和性能與Orbitrap相比不相上下。但對于長程的臨床樣本分析，傳統高分辨質譜儀有兩個限制，一個是儀器對溫度穩定性的需求比較高，即使實驗室溫度保持得很好，仍然會有一些漂移。第二是儀器的穩定性、抗污染性。目前的傳統高分辨質譜儀技術已有很大改善，從小樣本規模的生物學研究角度來講，傳統高分辨質譜儀也能滿足但對于長程的臨床樣本而言首選480進行數據采集。”

　　“最初調整到Orbitrap平臺需要很大的工作量，需要將代謝物數據庫等重新采集并做技術遷移，包括一整套的數據處理算法、軟件平臺參數調整等多個方面。賽默飛公司對我們也提供了很大的支持，在2019我們有幸使用了一臺QE plus后，我們體驗得不錯，發現解決了臨床樣本長程穩定性數據采集的痛點，后來就采購了Expolaris 480。我們的合作對雙方都有價值。我們的算法和數據庫最早僅支持Q-TOF，現在可支持Q-TOF和Orbitrap多種平臺，包括MetDNA、MetTracer和代謝物數據庫等一整套平臺。”

　　讓質譜儀走進千家萬戶實驗室

　　朱正江展望科學儀器的未來發展時說：“近幾年的儀器發展速度很快。對于代謝組學研究而言，未來一定希望儀器越來越‘傻瓜化’，甚至是像PCR儀一樣，本科生就能操作。如果想讓質譜儀走向千家萬戶的實驗室，一定要更簡單更傻瓜。這個傻瓜化的過程，既需要硬件支持的傻瓜化，也需要軟件支持的傻瓜化。以我們實驗室為例，做代謝組學的前處理操作盡可能簡單，血清、尿液樣本直接加入甲醇沉淀然后上機進樣即可。即更簡單的前處理，讓儀器和軟件來處理復雜的樣品和數據。”

　　“第二就是面對如此復雜的數據，數據分析軟件需盡可能精確地解析，力爭做到和PCR儀一樣的高準確度、高覆蓋度。人們希望一次進樣，獲得幾千個代謝物的信息，越多越好。儀器的未來發展，既需要硬件的創新，也需要軟件的創新，兩者之間要相互結合。”

　　朱正江強調：“現在國內都提倡做自主研發的儀器，但很少提到軟件的自主研發。在代謝組學領域里，希望通過我們的努力，在未來的5-10年里能夠稍微改變現狀，希望更多的人能參與，讓中國的國產儀器有自主的硬件和軟件的結合。另外就是標準化，質譜儀器想要廣泛應用需要標準化，讓一部分質譜儀能夠進入成千上萬的實驗室中。”

代謝組學分析技術和數據解析要齊頭并進

　　代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，隨著代謝組學的迅猛發展已涉及疾病診斷、醫藥研制開發、營養食品科學、毒理學、環境等多項與人類健康密切相關的領域。

　　國內代謝組學的研究也遍地開花，大連化物所許國旺研究組利用多維色譜分離分析技術輔助代謝物的分離分析；復旦大學唐惠儒老師課題組通過衍生化和靶向分析的方法分析代謝組學；中國醫學科學院藥物研究所再帕爾·阿不力孜科研團隊通過質譜分子成像技術研究空間代謝組學……一批國內前沿代謝組學研究已經完全形成自有特色，比肩國際水平。

　　與之相比，與國外同行相比差異較大的是代謝組學數據分析技術。朱正江強調：“代謝組學研究產生龐大的數據，解析如此龐大的數據需要大量的軟件。國內的代謝組學研究在分析技術方面的發展與國外齊頭并進，在個別領域如單細胞代謝組分析處于領先位置，但是在代謝組學數據分析方面相對比較落后。這包括了原始數據的分析軟件，從質譜峰的轉化到代謝物信息的一步步轉化，以及代謝物結構的鑒定。在這個過程中，國內代謝組學缺乏自主的特色的分析軟件和數據庫。”

　　因此在過去10年，朱正江課題組一直致力于代謝組學數據解析研究，包括原始數據處理、MetDNA化學結構鑒定、MetTracer標記代謝組學數據處理等。不僅如此，課題組也針對離子淌度質譜建立了大量的基礎數據庫和數據處理軟件。

　　朱正江補充說：“這是一個時代發展的趨勢，組學研究越來越成熟以后 ，既需要儀器公司的硬件支持，也需要很多軟件的支持，兩者相輔相成。”