昆蟲病毒的培養實驗

培養昆蟲病毒主要采取組織培養和感染宿主兩種方法，后者比較容易成功，使用更為廣泛。本實驗以斜紋夜蛾（Prodenialitura）核型多角體感染宿主來培養病毒。

斜紋夜蛾能危害棉花、蔬菜等多種作物。核型多角體病毒是多角體病毒侵入宿主細胞后，在細胞核內形成多角體，多角體內包含著很多病毒粒子。斜紋夜蛾多角體的形狀有三角形、四角形、五角形、六角形和圓形，直徑大小在 1.2～3.4 μm，用普通顯微鏡即可觀察到。多角體蛋白可被堿性溶液溶解，而釋放出病毒粒子。因此，多角體通過污染食物經口感染后，被昆蟲的堿性胃液所溶解，釋放的病毒粒子通過中腸上皮組織而進入血腔，在脂肪組織及其他組織（包括血細胞）中增殖。斜紋夜蛾感染病毒后明顯的特征是體色變化， 30℃ 下感染后 3 d 左右幼蟲腹面體色由正常的綠色變為粉紅色。發病后期，食欲減退，行動遲緩，死亡前半天到一天，停止攝食，排稀糞，幼蟲常向上爬行，在自然界常倒懸或附著于枝葉上而死亡。在病毒大量繁殖后，血液中出現大量多角體，通過皮膚可以看到血液呈混濁狀，此時皮膚脆弱易破有時前腹背后端破裂，流出乳白色或稍帶粉紅色液體，似膿汁，具有很強的感染性。

斜紋夜蛾核型多角體病毒材料（保存于冰箱的蟲尸）三齡斜紋夜蛾幼蟲

蓖麻或甘薯葉片1％ 漂白粉或 5％ 石灰水甘油

玻璃缸紗布血球計數板顯微鏡離心機

1. 病毒懸液制備

1.1 將斜紋夜蛾核型多角體病毒材料加適量蒸餾水置研缽中研磨，加水稀釋并通過兩層紗布過濾，再將濾液離心（3000 r／min 離心 30 min）。

1.2 將離心后的沉淀物用蒸餾水懸浮，并再離心，這樣反復多次，即可得到初部提純的白色多角體。

1.3 將提純的多角體先用適量的蒸餾水均勻懸浮，并用血細胞計數板計數，然后再加水使稀釋成每毫升含 1×10⁸ 個多角體的懸液。

1.4 向上述懸液中加入每毫升含青、鏈霉素各 1500～2000 單位，以防止雜菌污染。

2. 接種

2.1 將由田間采來的健康三齡斜紋夜蛾幼蟲放于玻璃缸內，缸口用多層紗布蓋好。蟲口密度一般在 33 mm² 一頭左右為宜。

2.2 用 1％ 的漂白粉液或 5％ 石灰水浸泡蓖麻或甘薯葉片進行消毒，然后再用清水洗滌，晾干后，用上述核型多角體懸液浸泡或用蘸有多角體懸液的棉球涂抹，晾干。

2.3 待幼蟲經短時間的饑餓以后，將晾干的帶毒葉片放于玻璃缸內供食，通過幼蟲口食接種病毒。供食帶毒葉片的次數可為 1～3 次，一般供毒次數多則發病率高。蓋好紗布后，置 30℃ 溫室培養。

2.4 培養過程仍需喂食，加強管理與觀察。

3. 收獲與保存

3.1 在幼蟲死亡前，蟲體變白，通過皮膚看到血液混濁時，在尾角或腹腳處剪破，收獲膿汁，保存于甘油水溶液（水：甘油＝1：2）中，置冰箱保存。

3.2 或將膿汁經洗滌、離心，取多角體沉淀加乳糖制成糊狀，冷凍干燥保存。

3.3 若整個死蟲保存，則將未放出膿汁的病死蟲直接放甘油水溶液中，冰箱保存。

4. 涂片鏡檢

4.1 從尾角或腹腳取血涂片，加上蓋玻片。

4.2 于（600×）高倍鏡下觀察。