一、變性、還原和緩沖液置換1.在真空干燥器中濃縮 120 ug 混合蛋白樣品，直至完全干燥。 2.將蛋白樣品重新溶解在約 1ml 變性/還原緩沖液中，37°C 孵育 30 min，使樣品變性還原。 體積不掃要非常精確，因為在下一步操作中緩沖液還需置換。不過樣品體積越小，需要置換的時間就越短。 3.除去還原劑，降低尿素濃度以及除去緩沖液中的干擾成分。用約 4 ml 生物素化/胰酶消化緩沖液置換原液，在 Centricon YM-3 濃縮管中進行（4°C 離心）。 二、標記 Biotin-HPDP 和緩沖液置換4.標記所有自由巰基。加入 50ul 4 mmol/L Biotin-HPDP(溶于 DMSO 中）到樣品中（第③步操作后樣品體積約為 1ml)，室溫孵育標記混合物 90 min。 由于不確定標記反應是否能在 2mol/L 尿素存在的情況下有效進行, 所以可加人過量的 Biotin-HPDP。Biotin-HPDP 的量應大于親和柱的結合能力（理論上，Img 抗生物素蛋白可結合 59nmol 的生物素）。 5.用新鮮的生物素/胰酶消化緩沖液置換原液，以除去未結合的 Biotin-HPDP。 置換在 CentriconYM-3 濃縮管中進行（4°C 離心）。 未結合的 Biotin-HPDP 會與生物素化的多肽競爭結合抗生物素蛋白。 第③步用過的 CentriconYM-3 濃縮管可在這一步重復使用。 三、標記后蛋白混合物的消化6.加 1.5ug 胰酶到生物素化的樣品中，孵育消化過夜（37°C)。 7.用 PBS(含 1mmol/L EDTA) 稀釋樣品消化產物，使尿素濃度降到0.5 mol/L 以下。 如果在幾個小時內就用于抗生物素親和柱，樣品則可以在室溫、4°C 或冰凍保存。若需要留存更長時間，則保存在-80°C。 四、固定化抗生物素親和柱捕獲及洗脫8.用 5 ml PBS(含 lmmol/LEDTA) 平衡 1ml 固定化抗生物素親和柱。 9.將消化后的樣品（來自第⑦步）加到親和柱上，封閉親和柱，室溫孵育 30 min。注意不要讓柱子變干。 10.為收集不含半胱氨酸的多肽，用 10 ml PBS(含 1mmol/LEDTA) 淋洗柱子，并收集洗脫液。這樣可獲得穿透組分。 11.從固定化抗生物素親和柱上洗脫含半胱氨酸的多肽。 （1）加 2 ml 含 50 mmol/LDTT(現用現加）的 PBS 到柱子上，使其進入柱子。 （2）封閉柱子，室溫孵育 30 min。 （3）打開柱子，收集 2 ml 洗脫液，得到結合組分。 五、烷基化和除鹽12.如果要進行 LC-MS/MS 分析，需用 IAA(分別為 10 mmol/L 和 100 mmol/L) 對穿透組分和結合組分分別進行烷基化，避光室溫作用 30 min。 13.用 90% 甲酸酸化肽段（分別加 20 沁到結合組分，IOOiLd 到穿透組分），使甲酸終濃度為 1%。在脫鹽前一直將樣品保存在-80°C。 14.根據廠商提供的使用說明，在 LC-MS/MS 之前用 Oasis HLB 抽提柱（或類似設備）對各個組分進行脫鹽。 展開 | 