幾十年來，DNA一直被認為是決定生命遺傳信息的核心物質，但是近些年不斷的研究表明，生命遺傳信息從來就不是基因所能完全決定的，比如科學家們發現，可以在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，這種改變不僅影響個體的發育，而且還可遺傳給后代。如腫瘤等多種疾病并非僅由基因突變而引起，且與DNA和組蛋白修飾等改變而引起的基因異常表達密切相關，這就是我們今天要分享的一個新領域——表觀遺傳學。隨著基因編輯技術的快速發展，目前不僅可以在DNA水平高效編輯校對，同時也可在不改變基因序列的情況下對基因進行操縱，進一步達到相應基因轉錄調控目的，成為了精準醫療的研究熱點。
何為表觀遺傳學？
遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因丟失等；而表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等。2018年發表在國際知名期刊NEJM（The new England journal of medicine）重磅綜述中提到，表觀遺傳學主要包括四大類[1]：
▼ DNA甲基化：它是5'端核苷酸胞嘧啶的共價修飾，通常與基因沉默有關，是表觀遺傳信息的最清晰的例子；
▼ 核心組蛋白翻譯后修飾：如乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化等。每種修飾都與基因活性、基因沉默或活性與非活性基因區域之間的絕緣有關；
▼ 高階染色質結構：包括通過染色體構象捕獲方法揭示的環組織（即用于分析細胞中染色質的高階組織的技術）；有組織的染色質賴氨酸（K）修飾（LOCKs），和涉及多基因區域的核區域的核層結構域（LAD）。
▼ 非編碼RNA：如常見的siRNA,piRNA,miRNA及長非編碼RNA都屬于表觀遺傳的范疇。
大量研究表明疾病的發生與表觀遺傳學密切相關，癌癥是常見表觀遺傳疾病的范例。例如甲基化變異性的增加，與白血病和淋巴瘤中侵襲性更強有關，在造血系統腫瘤的結局預測中也有類似的觀察結果，慢性淋巴細胞白血病顯示出更高的內部甲基化變異性。這種表觀遺傳變化，特別是表觀遺傳標記的變異性，可能是有價值的、診斷和預后癌癥的工具。如下圖為正常細胞和腫瘤細胞在表觀遺傳上的對比：
圖1. 表觀遺傳在正常細胞和癌細胞的變化（來源NEJM）
基因編輯如何在表觀基因組操控？
基因編輯工具的迅速發展使得在天然染色質環境中有針對性地進行表觀基因組編輯和轉錄調控成為可能，特別是CRISPR/Cas9技術的發展。
優勢：能夠調控基因的表達而不會造成永久性的DNA損傷，因而不會產生有害突變和脫靶效應；并且表觀遺傳療法可以通過同時調節多個基因活性來提供更好的治療效果，彌補基因治療存在的不足。
治療原理：目前，表觀遺傳修飾和轉錄調控的設計主要基于核酸酶的結合運用，其中以工程化缺陷型核酸酶（dCas9）的結合最為有效[2]。dCas9是Cas9蛋白的突變體，即Cas9蛋白的RuvC1和HNA兩個核酸酶活性區域同時發生突變。因此，dCas9蛋白的內切酶活性完全消失，只保留由gRNA引導進入基因組的能力。
圖2. dCas9示意圖[2]
CRIPSR-dCas9系統提供了一個研究轉錄調控和進行表觀基因組編輯的平臺，其設計原理在于把各種表觀調控效應器融合到dCas9上，通過核酸酶的靶向并結合目標DNA的特性實現特定基因組位點上表觀基因組的編輯。這些反式調控結構域和蛋白是通過向啟動子區域的dCas9靶向位點阻礙RNA聚合酶的結合或募集內源性轉錄復合物來發揮作用的。以下就是它的兩類主要作用模式：
第一類：dCas9融合轉錄因子或轉錄原件，通過招募轉錄因子或修飾因子起到調控作用。以下便是常用的一些基礎原件：
▼ 常用的抑制因子：dCas9 -KRAB [3-4] 。在這個系統中，dCas9與Kox1的轉錄阻遏物結構域KRAB（Kruppel-associated box）融合，這種增強的CRISPRi系統依靠KRAB招募各種各樣的組蛋白修飾因子，通過形成異染色質的方式可逆地抑制基因表達。
▼ 常用的激活因子：dCas9-VP64[5-6]。VP64是一種RNA結合蛋白，可以與轉錄因子的轉錄活化結構域結合，從而提高基因的表達水平。
▼ 除了這些因子之外，dCas9-VPR[7]和dCas9-TV[8]是比dCas9-VP64更有效的轉錄激活劑。
第二類：dCas9與表觀遺傳修飾酶來進行融合，直接催化DNA或者組蛋白的表觀修飾，調控基因的表達。
dCas9-DNMT3A已被證實可使靶向啟動子上的DNA瞬時甲基化[9]，從而抑制基因的表達。相比之下，使用dCas9-TET1則可實現啟動子的快速和瞬時DNA去甲基化，誘導靶基因的表達上調[9-10]。此外，通過dCas9-PRDM9和dCas9 -DOT1L可以實現組蛋白穩定的甲基化，以重新啟動表觀遺傳相關沉默基因的表達[11]。目前也有研究報道通過dCas9-LSD1誘導增強子的組蛋白脫甲基化，可下調靶基因的表達[12]。通過使用dCas9-P300[13]和dCas9-HDAC3[14]，在靶向增強子和啟動子區域可實現組蛋白瞬時高效的乙酰化和脫乙酰化，調控基因的表達。各種調控效應器同dCas9的結合極大地擴展了CRISPR在轉錄調控和表觀基因組編輯的應用范圍，而相關研究也表明核酸酶的表觀基因組編輯具有極高的安全性和特異性，并且沒有明顯的脫靶效應[3],[15]，為體內表觀基因修飾和治療奠定了基礎。
細心的讀者可能注意到了，CRISPR介導的表觀遺傳調控與我們之前介紹過的單堿基編輯工具也是有一定的相同之處的。單堿基編輯系統和表觀遺傳調控系統都是利用了缺陷型的Cas9蛋白（前者是只產生nick而不產生DSB的nCas9，后者是完全失去內切酶活性的dCas9），而且兩者都是通過融合蛋白來起到工作效果（前者是融合堿基編輯蛋白，后者是融合激活因子或抑制因子）。下圖是一個單堿基編輯與表觀基因組編輯的示意圖，讀者們可以感受一下其中的奧妙。
圖3. 單堿基編輯與表觀基因組編輯示意
在基因治療上的研究進展
其實，基因組表觀遺傳修飾的異常與許多疾病的發生與發展息息相關，如生活中常見的代謝紊亂、心血管疾病和癌癥等等。基于蛋白編碼的基因研究是不足以解釋這一類疾病的發生機理的，這些疾病的發病機制主要是基因和環境共同作用的結果。轉錄調控和表觀遺傳修飾改變的可逆性為治療這類疾病提供了新的希望。基因定點修飾技術的發展更為其精準治療增加了可能。
目前利用轉錄調控和表觀遺傳定點修飾技術在體內治療表觀遺傳異常引起疾病的研究還屈指可數。接下來小編就帶大家回顧一下現有的基因編輯結合表觀遺傳治療的代表工作。
1. 常見體細胞遺傳疾病
▼ 致病機理：體細胞中由于遺傳缺陷導致的疾病。
▼ 代表工作：2017年，一項研究采用了一種gRNA融合MS2-P65-HSF1（MPH）轉錄激活復合物的策略，將截短的gRNA（dgRNA）和MPH包裝到兩個單獨的AAV載體中，共同遞送到表達dCas9的轉基因小鼠中。通過靶向激活相應的功能性基因成功地修復了I型糖尿病、急性腎損傷和肌營養不良的疾病表型[16]。
圖4. 通過CRISPR介導的表觀遺傳調控激活體內靶基因進行遺傳疾病治療[16]
2. 神經系統疾病
▼ 致病機理：神經細胞中由于遺傳缺陷導致的疾病
▼ 代表工作：同時另一項突破性的工作則使用一種SunTag（dCas9-10xGCN4）系統融合多個拷貝的轉錄激活蛋白（p65-HSF1），構建了一種Cre依賴性的SunTag-p65-HSF1（SPH）轉基因小鼠模型。使用AAV8將Cre和sgRNAs遞送到SPH轉基因小鼠中，通過激活內源性神經源性轉錄因子的表達，在小鼠體內成功地實現了星形膠質細胞直接轉化為功能性的神經元[17]。這一研究表明，在不需要使用外源重編程因子或轉錄因子的前提下，通過轉錄調控的CRISPR系統可以實現特定細胞的重編程或不同細胞類型之間的轉分化，為體外細胞基因治療遺傳疾病提供了新的策略。
圖5. Cre誘導的dCas9小鼠[21]
3. 單倍體劑量不足引起的疾病
▼ 致病機理：單倍劑量不足(haploinsufficiency )指一個等位基因突變后，另一個等位基因能正常表達，但這只有正常水平50%的蛋白質不足以維持細胞正常的生理功能。
▼ 代表工作：近日，Science在線發表了一篇使用CRISPRa系統在小鼠中成功修復一種因單倍劑量不足引起的肥胖。研究人員通過AAV在SIM1基因或MC4R基因部分功能喪失的小鼠腦部遞送dCas9-vp64和sgRNA的方式成功激活了SIM1或MC4R蛋白的表達，成功抑制了肥胖的表型[18]。這一策略給罹患單倍體劑量不足引起的疾病患者帶來轉機。
圖6. 通過CRISPRa治療單倍體劑量不足相關疾病[18]
4. 異常甲基化引起的疾病
▼ 致病機理：基因中CpG島中的5' C經常突變引起高甲基化、羥甲基化等修飾，研究表明這些異常修飾會影響基因的表達調控，最終引起疾病[19]。
▼ 代表工作：脆性X綜合征（Fragile X syndrome, FXS）就是一種由FMR1基因5' UTR 區中CGG三核甘酸重復序列擴增突變并高甲基化，使FMR基因沉默而導致的疾病。最近的一項研究通過利用dCas9融合Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶1（Tet methylcytosine dioxygenase 1, Tet1）轉染FXS iPSCs 細胞系，成功靶向誘導FMR基因5' UTR CpG島去甲基化，為這些因異常甲基化引起的疾病的治療奠定了基礎[20]。
圖7. 脆性X綜合征相關疾病的表觀遺傳治療[20]
怎么樣，這次的公眾號是不是讓大家大開眼界呢？相信通過這四期的公眾號，大家已經對基因編輯在疾病治療中的研究應用有了較為系統的了解，不過“路漫漫其修遠兮”，從實驗室走到臨床還有較為漫長的距離要走。但是大量的實驗已經給我們看到了未來疾病治療的新曙光，相信終有一天，基因編輯治療的大時代終會到來。
參考文獻：（向下滑動查看）
[1]Feinberg AP. The Key Role of Epigenetics in Human Disease Prevention and Mitigation. N Engl J Med. 2018, 378(14): 1323-1334.
[2]Brocken DJW, Tark-Dame M, Dame RT. dCas9: A Versatile Tool for Epigenome Editing. Curr Issues Mol Biol. 2018, 26:15-32.
[3]Thakore PI, D'Ippolito AM, Song L, Safi A, Shivakumar NK, Kabadi AM, Reddy TE, Crawford GE, Gers-bach CA. Highly specific epigenome editing by CRISPRCas9 repressors for silencing of distal regulatory ele-ments. Nat Methods, 2015, 12: 1143-1149.
[4]Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of tran-scription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442-451.
[5]Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, Fu Y, Ho QH, Joung JK. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods, 2013, 10(10): 977-979.
[6]Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, Adler AF, Kabadi AM, Polstein LR, Thakore PI, Glass KA, Oust-erout DG, Leong KW, Guilak F, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9 -based transcription factors. Nat Methods, 2013, 10(10): 973-976.
[7]Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, Tuttle M, P R Iyer E, Lin S, Kiani S, Guzman CD, Wiegand DJ, Ter-Ovanesyan D, Braff JL, Davidsohn N, Housden BE, Perrimon N, Weiss R, Aach J, Collins JJ, Church GM. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods, 2015, 12(4): 326-328.
[8]Li Z, Zhang D, Xiong X, Yan B, Xie W, Sheen J, Li JF. A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells. Nat Plants, 2017, 3(12): 930-936.
[9]Liu XS, Wu H, Ji X, Stelzer Y, Wu X, Czauderna S, Shu J, Dadon D, Young RA, Jaenisch R. Editing DNA methylation in the mammalian genome. Cell, 2016, 167(1): 233-247.
[10]Liu P, Chen M, Liu Y, Qi LS, Ding S. CRISPR-based chromatin remodeling of the endogenous Oct4 or Sox2 locus enables reprogramming to pluripotency. Cell Stem Cell, 2018, 22(2): 252-261.
[11]Cano-Rodriguez D, Gjaltema RA, Jilderda LJ, Jellema P, Dokter-Fokkens J, Ruiters MH, Rots MG. Writing of H3K4Me3 overcomes epigenetic silencing in a sustained but context-dependent manner. Nat Commun, 2016, 7: 12284.
[12]Kearns NA, Pham H, Tabak B, Genga RM, Silverstein NJ, Garber M, Maehr R. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods, 2015, 12(5): 401-403.
[13]Hilton IB, D'Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol, 2015, 33(5): 510-517.
[14]Kwon DY, Zhao YT, Lamonica JM, Zhou Z. Locus specific histone deacetylation using a synthetic CRISPRCas9-based HDAC. Nat Commun, 2017, 8: 15315.
[15]Mendenhall EM, Williamson KE, Reyon D, Zou JY, Ram O, Joung JK, Bernstein BE. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat Biotechnol, 2013, 31(12): 1133-1136.
[16]Liao HK, Hatanaka F, Araoka T, Reddy P, Wu MZ, Sui Y, Yamauchi T, Sakurai M, O'Keefe DD, Nú?ez-Delicado E, Guillen P, Campistol JM, Wu CJ, Lu LF, Esteban CR, Izpisua Belmonte JC. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell, 2017, 171(7): 1495-1507.
[17]Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, Rao Z, Li H, Hu X, Li C, Yao X, Shen X, Sun Y, Wei Y, Liu F, Ying W, Zhang J, Tang C, Zhang X, Xu H, Shi L, Cheng L, Huang P, Yang H. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci, 2018, 21(3): 40-446.
[18]Matharu N, Rattanasopha S, Tamura S, Maliskova L, Wang Y, Bernard A, Hardin A, Eckalbar WL, Vaisse C, Ahituv N. CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency. Science, 2018.
[19]Xu Y, Wu F, Tan L, Kong L, Xiong L, Deng J, Barbera AJ, Zheng L, Zhang H, Huang S, Min J, Nicholson T, Chen T, Xu G, Shi Y, Zhang K, Shi YG. Genome-wide regulation of 5hmC, 5mC, and gene expression by Tet1 hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol Cell, 2011, 42(4): 451-464.
[20]Hayashi ML, Rao BS, Seo JS, Choi HS, Dolan BM, Choi SY, Chattarji S, Tonegawa S. Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene. Cell, 2018, 172(5): 979-992.e6.
[21]Lau CH, Suh Y. In vivo epigenome editing and transcriptional modulation using CRISPR technology. Transgenic Res. 2018, 27(6):489-509.
索取資料
來源：上海邦耀生物科技有限公司
聯系電話：021-64340008
E-mail：service@bioraylab.com