斷裂標記免疫電鏡技術（1）

斷裂-標記免疫電鏡技術

此法是先進行冷凍斷裂，再做免疫標記，從而可以對斷裂開的各種膜結構及胞漿斷面進行標記。

(1)臨界點干燥法

①固定:1.0%~2.5%戊二醛PBS液4℃1~2h，PBS沖洗3min×3。

如為細胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油-PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。

②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養皿中，培養皿放置于二氧化碳-液氮槽中，用預冷的解剖刀切割凝膠小塊進行冷凍斷裂。

③解凍，置碎塊于30%甘油-1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。

④置換甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。

⑤免疫標記。

⑥1%鋨酸，室溫固定30min。

⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴鍍鉑-碳膜，次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗，撈于有Formvar 膜銅網上透射電鏡觀察。