排阻色譜的分離機理是立體排阻，樣品組分與固定相之間不存在相互作用的現象。色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網狀物質。凝膠的孔穴大小與被分離的試樣大小相當。僅允許直徑小于孔開度的組分分子進入，這些孔對于流動相分子來說是相當大的，以致流動相分子可以自由地擴散出人。對不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內的不同深度，大個的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內，但進不了小孔，甚至于完全被排斥。小個的組分分子，大孔小孔都可以滲進去，甚至進入很深，一時不易洗脫出來。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時間較短，很快被洗出，它的洗脫體積（即保留時間）很小。小的組分分子在色譜柱中停留時間較長，洗脫體積卿保留時間）較大，直到所有孔內的最小分子到達柱出口，這種按分子大小而分離的洗脫過程才告完成。 因為分子尺寸一般隨分子量的增加而增大，所以根據分子量表達分子尺寸比較方便。將因分子過大而不能部分地進入某一給走固定相孔內的最小的樣品粒子的分子量，定義為該固定相的排阻極限。