抗CRISPR蛋白的原理機制研究

　　CRISPR 基因座和 Cas 蛋白在原核生物中提供針對入侵的噬菌體和質粒的適應性免疫。作為回應，噬菌體已經進化出廣譜的抗 CRISPR 蛋白（抗 CRISPR）來抵消和克服這種免疫途徑。迄今為止，已經鑒定出許多抗 CRISPR，它們抑制單亞基 Cas 效應器（在 CRISPR 2 類、II、V 和 VI 型系統中）和多亞基級聯效應器（在 CRISPR 1 類、I 型和 III 型系統中）。結合效應復合物的抗 CRISPR 的晶體學和冷凍電子顯微鏡結構研究，輔以體外和體內的功能實驗，確定了四種主要的 CRISPR-Cas 抑制機制：抑制 CRISPR-Cas 復合物組裝、阻斷靶標結合、防止靶標裂解和環狀寡核苷酸信號分子的降解。

　　2021年6月4日，南方科技大學賈寧及紀念斯隆凱特琳癌癥中心Dinshaw J. Patel共同通訊在Nature Reviews Molecular Cell Biology （IF=55.47）在線發表題為“Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins”的綜述文章，該綜述討論了從 X 射線晶體學和冷凍電子顯微鏡研究中出現的關于抗 CRISPR 功能的新機制見解，以及這些結構與功能研究相結合如何為不斷發展的 CRISPR-Cas 生物技術提供有價值的工具，用于精確和強大的基因組編輯和其他應用程序。

　　感應外來核酸是所有生物體中最常見的細胞免疫策略之一。在真核生物中，細胞質中存在 DNA 可以激活 cGAS-STING 信號通路，從而通過產生 I 型干擾素來激活先天免疫。不出所料，病原體已經進化出各種方法來克服這種防御。在原核生物中，細菌和古細菌已經進化出多種免疫系統，包括先天性和適應性免疫系統，以通過靶向此類“入侵”核酸來防止噬菌體感染，包括通過先天限制性修飾系統切割入侵的噬菌體基因組以及Cas 基因系統，通過記憶來自噬菌體 和質粒的過去入侵核酸，為原核生物提供適應性免疫。

　　作為回應，噬菌體進化出多種對抗策略來逃避這些抗病毒系統，包括限制位點的修飾或限制-修飾輔因子的降解。也可以通過選擇 CRISPR-Cas 靶向序列中的點突變或形成核樣結構（阻止目標識別或切割）或通過生成抗 CRISPR 蛋白來逃避基于 CRISPR-Cas 的免疫(anti-CRISPRs) 直接滅活 CRISPR-Cas 效應復合物 。

　　CRISPR-Cas 系統分布廣泛，已在大約 85% 的古細菌和大約 40% 的細菌完全測序基因組中被發現。值得注意的是，CRISPR-Cas 系統高度多樣化，目前分為兩大類，它們總共包括六種類型，根據系統發育、cas 基因組成和作用機制進行分類。 1 類系統（包括 I、III 和 IV 型）由多亞基效應復合物組成，而 2 類系統（包括 II、V 和 VI 型）包括單亞基效應蛋白。

　　盡管存在這些差異，但所有系統都依賴于相同的基本行動原則，跨越三個主要階段：適應、表達和干擾。在第一個適應階段，來自入侵者的小 DNA 片段（稱為間隔區）被整合到宿主 CRISPR 基因座中以免疫宿主細胞；這種間隔區的結合產生了感染的遺傳記憶；在防御的第二階段，CRISPR 基因座被轉錄成前體 CRISPR 衍生的 RNA (crRNA)，并進一步加工成短的成熟 crRNA。最后，在目標干擾階段，單個crRNA與Cas蛋白組裝形成crRNA-效應復合物，負責對入侵核酸進行序列特異性識別和降解。然而，與其他防御系統相比，CRISPR-Cas 系統的自適應特性也使它們能夠獲得新的間隔區來對抗這些噬菌體“逃逸者”；因此，單獨的誘變不足以使噬菌體長期存活。

　　為了對抗 CRISPR-Cas 監視復合物的適應性，噬菌體進化出了 CRISPR-Cas 系統的蛋白質抑制劑，稱為抗 CRISPR（Acr 蛋白），它于 2013 年首次被發現。隨后，抗 CRISPR 的知識迅速擴展，迄今為止，包括在天然可移動遺傳元件中鑒定的 88 種抗 CRISPR 蛋白 ，以及一種非源自噬菌體的合成小分子抑制劑。

　　這些報道的抗 CRISPR 跨越 5 個 CRISPR-Cas 亞型，包括 2 類 II、V 和 VI 型以及 1 類 I 和 III 型，迄今為止尚未報告 IV 型。通過多種方法發現了不同的抗 CRISPRs 在它們之間沒有共享序列特征。生化和結構研究揭示了其中 29 種抗 CRISPRs 的特定功能機制，揭示了四種主要的對抗CRISPR-Cas 系統策略：抑制 CRISPR-Cas 復合物組裝、阻斷靶標結合、防止靶標裂解和環狀寡核苷酸信號分子的降解。

　　由于其 RNA 引導、序列特異性識別能力，CRISPR-Cas 系統已被重新用作強大的基因操作工具，用于基因和基因組編輯、基因調控 、成像和分子診斷 。這項技術的簡單性和穩健性已將基因操作從一項基礎科學技術轉變為用于一系列醫療應用的工具。然而，突出的挑戰仍然與基因操作過程的安全方面有關，這可能導致脫靶效應和細胞毒性。Anti-CRISPRs 能夠干擾 CRISPR-Cas 活動，并可能為 CRISPR-Cas 衍生的基因組編輯工具提供時間、空間和條件控制。

　　在這篇綜述中，對抗 CRISPR 的最新發現、機制和應用進行了最新的表征和討論。與之前的綜述相比，該綜述強調了從最近的 X 射線晶體學和冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 研究中獲得的新機制見解，通過競爭性結合、變構控制和酶抑制 Cas 蛋白和多亞基級聯復合物來抑制抗 CRISPR。對 CRISPR-Cas 調控的這種分子理解應該有助于開發精確和更好控制的基于 CRISPR-Cas 的基因組操作工具。