成功恢復生殖功能！廣醫三院安庚團隊構建“無細胞”水凝膠支架，修復兔陰莖海綿體缺陷

　　近日，廣州醫科大學附屬第三醫院安庚教授團隊在 Advanced healthcare materials 期刊發表了題為：Exosomes from Hypoxia Preconditioned Muscle-Derived Stem Cells Enhance Cell-Free Corpus Cavernosa Angiogenesis and Reproductive Function Recovery 的研究論文【1】。

　　該研究利用低氧預處理肌源性干細胞（MDSC）來源的外泌體來修飾3D打印的GelMA水凝膠支架，實現無細胞組織再生，成功修復兔陰莖海綿體缺損，恢復生殖功能并生育子代。

　　這項研究是繼安庚教授團隊2020年在 Nature Communications 期刊發表“全球首次”利用3D打印技術及干細胞成功修復海綿體缺損，使兔子恢復勃起和射精功能，并恢復生殖能力的研究成果后【2】，再次取得重要突破，為海綿體重建恢復男性生殖能力提供了重要的參考價值。這項研究為開發個性化的“無細胞”海綿體支架提供了新的思路，更好的推進臨床轉化。

　　聚焦問題，提出方案

　　臨床中各種先天性男性外生殖器發育異常、陰莖腫瘤切除手術、會陰部外傷導致的陰莖缺損、血管性勃起功能障礙，陰莖硬結癥等均需要進行陰莖海綿體重建手術，修復陰莖的生理結構和功能缺陷。受限于天然海綿體組織的嚴重缺乏和人同種異體陰莖移植的倫理爭議，陰莖海綿體組織工程具有潛在的重要臨床應用價值。

　　GelMA水凝膠作為生物支架在陰莖海綿體組織再生和功能修復方面展現了廣闊的應用前景。微血管系統重建是組織工程修復陰莖海綿體缺損的關鍵步驟。常用于促進血管網絡生成的主要方法，包括單純注射各類促血管生長因子，如血管內皮生長因子等，或通過轉染干細胞建立過表達譜系。研究團隊以肌源性干細胞（MDSC）作為種子細胞，利用三點位突變方式構建了高表達穩態低氧誘導因子1α（HIF-1α）的MDSCs系。過表達HIF-1α的MDSC接種在3D打印的HAMA-GelMA生物支架顯示了較好的促血管形成的效果。但是，基因轉染的干細胞均存在一定的生物安全問題，且種植量有限，后續增殖、分化代數有限。包括倫理因素在內，都限制了干細胞作為組織工程陰莖海綿體的重要組成部分未來在臨床的轉化空間和前景。

　　研究顯示，不使用外部種子干細胞的再生，稱為無細胞再生，是解決這些細胞來源問題的一種很有前途的方法。外泌體作為細胞外囊泡（EV）的一個群體，攜帶多種細胞旁分泌的分泌物，包括蛋白質、RNA和脂質。自然產生的外泌體繼承了起源細胞的生理特征。當在體內治療時，外泌體與原始細胞治療相比，顯示出相當的效力和更好的安全性，這表明它們作為無細胞治療的潛在用途。目前研究均表明外泌體在血管重塑中具有重要作用。

　　缺血組織中細胞行為的一個重要調節因子是缺氧微環境，而體外培養的肌源性干細胞通常暴露在21%的O2環境中，這與陰莖海綿體缺損后缺氧微環境的不一致。研究表明，缺氧預處理可增強干細胞的生物學功能，改善其治療效果.

　　研究團隊假設，H-Exos在陰莖海綿體組織工程中可以促進陰莖海綿體缺損的血管新生、恢復陰莖勃起及生殖能力。在這項研究中，研究團隊比較了N-Exos和H-Exos對臍靜脈血內皮細胞（HUVEC）的影響。此外，研究團隊還確定了缺氧預處理是否會導致miRNAs的不同程度的表達，并研究了其對HUVEC的生物學效應和潛在的調節機制。最后，構建并移植含有H-Exos的EGCG改性的GelMA水凝膠海綿體支架，觀察支架修復兔陰莖海綿體缺損的能力，以及恢復兔陰莖勃起和生育能力。

　　構建力學性能匹配、生物相容性良好生物支架

　　研究團隊成功地使用3D打印技術制造了GelMA水凝膠支架。通過引入天然來源的氫鍵交聯劑表沒食子兒茶素（EGCG），在化學交聯網絡中添加氫鍵交聯位點，改善了GelMA水凝膠的機械性能和生物相容性，使其更適合作為組織工程的支架材料。經EGCG修飾的GelMA水凝膠（GelMA-EGCG）的力學性能得到增強，抗拉強度提高9.4 倍（從0.05MPa提高到0.47MPa），斷裂應變提高5倍（從22%提高到112%）。隨著浸泡時間的增加，GelMA-EGCG水凝膠的壓縮模量從0.021MPa增加到0.82MPa，浸泡24h后水凝膠的強度趨于穩定。GelMA-EGCG支架可以拉伸、彎曲和扭曲，表明GelMA-EGCG具有良好的機械穩定性，可以應用于陰莖這一高度動態的器官。在對照組、GelMA支架組和GelMA-EGCG支架組分別植入等量的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）。在24小時、 72小時和120小時后，使用熒光顯微鏡快速定量細胞活力。結果顯示，三組細胞存活率均保持在90%以上，表明3D打印支架具有良好的生物相容性。

　　提取并驗證低氧外泌體在促進血管生成的作用

　　研究團隊前期已建立肌源性干細胞外泌體的提取和鑒定建立的體系。在該研究采用了常氧和低氧的培養條件，以獲取常氧-MDSC來源的外泌體和低氧-MDSC來源的外泌體。為了進一步探討H-Exos和N-Exos對HUVEC細胞增殖是否存在功能性差異，HUVEC被分別采用PBS、N-Exos或H-Exos進行處理。H-Exos組EdU陽性細胞的百分比中明顯高于PBS對照組和N-Exos組。在CCK-8實驗中，H-Exos展示出的OD值高于PBS對照組和N-Exos組，其中H-Exos組的增加最為顯著。這些結果證實了外泌體的加入刺激了HUVEC的增殖，其中H-Exos的影響更為顯著。研究團隊檢測了H-Exos及N-Exos在氧糖剝奪條件下對血管生成的影響。H-Exos顯著抑制了HUVEC的凋亡。此外，H-Exos組的管狀結構的長度顯著高于其他兩組。此外，H-Exos組的CD31、VEGF的相對mRNA表達量及CD31、VEGF的蛋白表達量顯著高于其他兩組。所有上述結果表明了H-Exos在促進血管生成中的顯著作用。

　　低氧外泌體通過過表達miR-21-5p和抑制PDCD4促進血管生成

　　為了研究H-Exos傳遞的miR-21  -5p在促進HUVEC增殖、遷移、成管中的潛在作用機制，研究團隊預測并驗證了PDCD4可作為miR-21調控潛在靶標。接下來，研究團隊檢測了PBS、N-Exos或H-Exos處理的HUVEC細胞中PDCD4的表達水平。H-Exos處理后HUVEC細胞組中，PDCD4的mRNA水平和蛋白表達均顯著降低。進一步，研究團隊利用過表達PDCD4的HUVEC （OE-PDCD4），進一步研究了H-Exos與PDCD4的關聯，結果顯示，PDCD4的過表達可以抑制H-Exos處理后的HUVEC細胞的增殖和成管。過表達PDCD4后，H-Exos處理的HUVEC中VEGF和CD31的mRNA水平和蛋白表達水平顯著下降。這些結果表明，低氧外泌體通過過表達miR-21-5p和抑制PDCD4促進血管生成。

　　兔海綿體損傷模型的建立及缺損修復效果及勃起功能評估

　　接下來，研究團隊構建了兔陰莖海綿體缺損模型。海綿體修復支架被植入模型兔的海綿體損傷部位。研究分組包括：陽性對照組（未進行手術操作）、陰性對照組（移除部分海綿體組織但未植入海綿體支架）、GelMA-EGCG組（不含外泌體）、N-Exos負載GelMA-EGCG組以及H-Exos負載GelMA-EGCG組。

　　每組在移植后28天，通過注射罌粟堿前后對海綿體動脈血流速度進行多普勒超聲測量。如預期，與陰性對照組、GelMA-EGCG組和N-Exos負載GelMA-EGCG組相比，H-Exos負載GelMA-EGCG組的海綿體在移植后通過罌粟堿注射評估時顯示出海綿體內血流的恢復。

　　磁共振成像（MRI）顯示，與陰性對照組和GelMA-EGCG組相比，N-Exos加載GelMA-EGCG組和H-Exos負載GelMA-EGCG組在移植后28天顯示出不同程度的受傷海綿體修復。從MRI三維重建圖像來看，H-Exos負載GelMA-EGCG組可以在缺陷部位顯著促進組織愈合和再生。這部分結果顯示，將缺氧外泌體支架植入兔子陰莖海綿體的缺陷部位，可以顯著恢復血供并促進缺陷修復。

　　陽性對照組、陰性對照組、GelMA-EGCG組、N-Exos負載GelMA-EGCG組和H-Exos負載GelMA-EGCG組在移植后14天和28天通過測量ICP/MAP值評估了勃起功能，在移植后14天，H-Exos負載GelMA-EGCG組的ICP/MAP比值高于陰性對照組。移植28天后觀察到，H-Exos負載GelMA-EGCG組的ICP/MAP比值顯著高于陰性對照組，接近于陽性對照組的水平。

　　海綿體血管生成的組織學評估及雌雄兔同籠交配評估

　　在移植28天后，H-Exos負載GelMA-EGCG組的血管生成標志物α-SMA和CD31的免疫熒光染色密度高于陰性對照組、GelMA-EGCG組和N-Exos負載GelMA-EGCG組。這些結果也得到了蘇木精-伊紅染色圖像的印證。

　　在含H-Exos的GelMA-EGCG組中，一只雌兔在同籠1月余后生下小兔。而在含N-Exos的GelMA-EGCG組中，在同籠2個多月后也成功生下小兔。在缺氧外泌體負載支架組和常氧外泌體負載支架組中出生的小兔表明，經過治療的雄性兔子能夠進行正常的勃起和射精。

　　持續創新、服務臨床

　　在這項研究中，研究團隊設計了一種具有良好力學性能和生物相容性的EGCG修飾的水凝膠支架，并將其作為H-Exos的載體；該生物支架應用于兔子缺損海綿體的修復，經過影像學檢查、形態學評估、ICP等證實，該組織工程支架成功修復了海綿體缺損并恢復了陰莖的勃起和射精功能，使陰莖海綿體缺損的雄兔成功恢復了生育能力。

　　安庚教授團隊2020年已構建了一種表面負載肝素涂層的具有多尺度多孔結構的仿生3D打印水凝膠支架，并向其中植入了HIF-1α突變的MDSC。在此基礎上，為了克服干細胞作為種子細胞用于組織再生，面臨著免疫排斥、增殖和分化受限，生物安全性等挑戰，本研究進一步提出了一種有效的無細胞再生水凝膠支架修復陰莖海綿體缺損的治療策略。這項最新研究證實了H-Exos聯合GelMA-EGCG支架的陰莖海綿體組織的無細胞再生策略在修復海綿體缺損和恢復勃起和生殖功能方面具有重要的潛力，具有重要的臨床轉化價值。