作者：周越球 陸松堯 梁立敏
【摘要】 戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的經消化道傳播的急性傳染病，發病率逐年升高，目前尚無特效治療方法，也無特異性被動和主動免疫制劑可供預防。在急性戊型肝炎患者中，血液或糞便中HEV RNA持續時間較短，操作復雜、成本高，不能在臨床廣泛開展。HE的診斷主要依靠血清HEV抗體檢測，抗-HEV IgM是HE急性感染的診斷指標之一，類風濕因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性。抗-HEV IgG一般在發病2周后可檢測到，可持續1年甚至數年，因此抗-HEV IgG不能鑒別患者為HEV急性感染還是既往感染。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指標，可代替或輔助現有IgM診斷試劑用于HE診斷，既增加了檢測特異性，又能有效減少漏診。
【關鍵詞】 戊型肝炎；戊型肝炎病毒；抗-HEV IgM；抗-HEV IgA；抗-HEV IgG
【Abstract】 Hepatitis E(HE),as the spread of acute gastrointestinal disease,is caused by hepatitis E virus(HEV).Its morbidity is increasing year and year.However,there is neither specific treatment nor specific passive and active immunity drug to prevent against the disease at present.HEV RNA in blood or stool of patients with acute Hepatitis E can not be widely used due to its short existed time,complicated operation and high cost.Diagnosis of Hepatitis E is made by detection of serum anti-HEV antibody.Anti-HEV IgM is a diagnosis index of acute Hepatitis E,which may be influenced by rheumatoid factor,resulting in false positive.Anti-HEV IgG can generally be detected two weeks after the onset of disease and for at least 1 year.Therefor ,it can not be used to distinguish acute infection from previous infection.Study has showed that anti-HEV IgA is a valuable index for diagnosing acute HEV infections,which is an alternative or supplementary antibody of IgM for detecting HEV infection,increasing high specificity and reducing missed diagnosis.
【Key words】 Hepatitis E;Hepatitis E virus;Anti-HEV IgM;Anti-HEV IgA;Anti-HEV IgG
HE是由HEV引起的經消化道傳播的急性傳染病，發病率逐年升高。有研究表明HEV還可通過血液途徑傳播[1]，而且最近發現HE在器官移植患者中可以慢性化[2]。HEV流行廣泛，呈全球性分布，主要累及衛生條件差的亞洲、非洲和中美洲等地區中的發展中國家，在西方發達國家也有散發病例報道，在未暴發HEV的地區人群可檢測到抗HEV抗體。在某些發展中國家，HE占成人急性病毒性肝炎的50%以上，盡管只有1%～3%的患者發展為致死性急性肝炎，病死率為2.5％，明顯高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎，孕婦感染后病死率可高達20%。我國曾發生11次HE的暴發或流行，是HE高發區之一，1986年至1988年新疆發生迄今為止規模最大的HE暴發性流行，約有12萬人感染[3]。據衛生部發布的傳染病疫情公示，近年來我國HE發病數呈現連續增長的態勢，死亡率也在逐年增加，已經被列為因HE發病和死亡而引起的經濟負擔最為嚴重的國家之一。
HEV是一個近似球形的二十面體顆粒，表面有突起和刻缺，形似杯狀，無包膜，平均直徑為32～34 nm。HEV對高鹽、氯化銫、氯仿等敏感，在70℃～80℃中易裂解，在液氮中穩定。HEV的基因組是一單股、正鏈RNA分子，全長約7.5 kb，由5′端非編碼區(NCR)、非結構區(NSR)、結構區(SR)、3′端NCR和3′端Poly(A)尾巴組成，5′端NCR和3′端NCR之間為編碼區，包含3個開放讀碼框(ORF1、ORF2和ORF3)。ORF1主要編碼與HEV復制相關的非結構蛋白，包括甲基轉移酶、蛋白酶、RNA解鏈酶及RNA聚合酶。ORF2編碼病毒衣殼蛋白，為主要的結構基因編碼區。ORF3位于ORF1和ORF2之間，與ORF1和ORF2有部分重疊，編碼病毒特異性的免疫反應抗原。作為一種單鏈RNA病毒，HEV基因組與蛋白質容易發生變異，根據HEV核苷酸序列同源性比較的結果，目前至少可以將HEV分成4個主要的基因型和多個亞型。基因型1：包括3個亞型，分別以HEV緬甸株(1a型)、巴基斯坦株(1b型)和摩洛哥株(1c型)為代表，以往以中國新疆株為代表的中國HEV與巴基斯坦株屬同一亞型；基因型2：以HEV墨西哥株為代表；基因型3：由美國株及大多數豬HEV組成；基因型4：包括新近發現的HEV中國株和臺灣株[3-4]。ORF2蛋白在已發現的HEV基因型中最為保守，具有很強的免疫原性，其編碼的氨基酸序列的同源性并不完全一致，第3型和第4型之間達94.6％，顯示了在種系進化上3、4兩型間的氨基酸序列相近，可能含有共同的抗原表位。第1型和第2型之間的氨基酸序列同源性達92.2％～92.8％。流行病學資料報道以往我國HE發病以1型毒株為主要病原體，近期的研究報告顯示4型HEV是目前引起我國散發性HE的主要病毒株[4]。
HE是一種嚴重危害人類健康的全球性疾病，目前尚無特效治療方法，也無特異性被動和主動免疫制劑可供預防。早期診斷，不僅對于患者的治療和改善預后具有重要意義，還可以及早發現具有傳染性的HE患者，準確評判HE急性感染、亞臨床感染、既往感染，對臨床處理及預后判斷有重要意義。做到及早隔離傳染源，防止病毒污染水源和食物，造成大規模暴發流行。
1 HEV RNA、抗-HEV IgA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG與HE的關系
1.1 HEV RNA與HE的關系
HE潛伏期平均4～6周，在出現臨床癥狀之前或同時即有糞便排毒和病毒血癥，然后才出現肝損害，血清HEV抗體在起病前1周左右開始升高，HEV RNA在血清或糞便中出現較早，HEV RNA的檢測是HE確診的指標，但大多數患者的病毒血癥持續時間較短，平均約為2周，病毒載量低，所以檢出率較低，故RT-PCR法檢測HEV RNA陰性的病例不能排除HE。鑒于PCR結果受標本采集時間的限制，而且PCR操作復雜、成本高、易受污染、會造成誤診或漏診，因此不宜作為常規檢測項目在臨床廣泛開展[5]。
1.2 抗-HEV IgM與HE的關系
目前HE的診斷主要依靠血清HEV抗體檢測，抗-HEV IgM是HE急性感染的診斷指標之一[6-7]，在感染HEV第2周就可以在血清中被檢測到，第6周達到高峰，隨后迅速下降，陽性持續時間較短(3個月左右)。而且抗-HEV IgM現有診斷試劑常有漏診和誤診。眾所周知，類風濕因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性，這在其他疾病檢測中屢見不鮮，抗-HEV IgM檢測也不例外[8-9]。而抗-HEV IgM檢測也常常有假陰性報道，Nicand等[5]在抗-HEV IgM陰性的HE亞臨床感染患者體內發現病毒血癥和糞便排毒；Mitsui等[10]也報道在醫療工作人員系列血清追蹤調查中，HE亞臨床型感染患者出現短暫病毒血癥，而IgM檢測持續陰性；Gotanda等[11]報道了在谷丙轉氨酶明顯升高的獻血員中，出現HEV病毒血癥卻無IgM反應性，等等。最近，Zhao等[9]又發現在11例HEV抗原陽性的HE患者血清中，抗-HEV IgM陰性。這部分漏診的帶毒者即成為HEV的移動傳染源，有可能是造成HE區域性小規模流行和持續散發的原因。這說明現有的IgM診斷試劑尚不能滿足HEV感染的臨床診斷和流行病學篩查與防治的需要。
1.3 抗-HEV IgG與HE的關系
抗-HEV IgG一般在發病2周后可檢測到，在第7周達到高峰，并能一直保持在較高的水平，至少可持續1年甚至數年，因此抗-HEV IgG不能鑒別患者為HEV急性感染還是既往感染[8,12]。有研究表明IgG抗體親和力高低測定可診斷是否為急性感染。通常感染初期IgG親和力低，恢復期IgG親和力高，但重復感染患者通常也表現為IgG親和力高。這種情況在孕婦弓型蟲感染患者中也有報道。雖然抗體親和力能用來區分感染時間，特別是亞臨床和無黃疸的患者，也可以鑒定抗-HEV IgM陰性的急性感染，但高和低親和力的區分不得不憑經驗，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG親和力都低，也有的患者發病早期抗-HEV IgG陽性，而親和力高，因此抗體親和力實驗只能作為一種驗證實驗[13]。
1.4 抗-HEV IgA與HE的關系
IgA作為免疫球蛋白中一個重要的成員，在黏膜免疫中起著重要的作用。認為可以作為外部屏障作用阻止病毒吸附到黏膜上皮細胞，同時攔截正在感染上皮細胞的病毒，并通過分泌作用將截獲的病毒送回到上皮細胞外，已經證實在脊灰病毒、漢坦病毒等感染中，IgA發揮不容忽視的作用[14-15]。EBV-VCA-IgA的檢測已被公認是鼻咽癌早期發現、早期診斷、預后監測及大規模普查的敏感、可靠、簡便的方法，是提高鼻咽癌早期確診率的有效途徑[16]。IgA抗體被證實在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作為早期診斷的標志。
在大部分HEV早期感染患者中，可檢測到抗-HEV IgM和抗-HEV IgA陽性，但抗-HEV IgA陽性持續時間比抗-HEV IgM長，平均約為(120±23)d，對HEV感染的早期診斷更有意義[8]。早在1993年Chau等[17]就發現血清抗-HEV IgA與IgM同步升高，在恢復期消失，可以作為HEV急性期的感染指標。近年來越來越多的研究證實了這種觀點[18-19]，IgA作為HEV急性診斷指標的研究越來越受到人們的重視。Takahashi等[20]在豬感染HEV的研究中發現，抗-HEV IgA與病毒血癥的相關性遠遠高于抗-HEV IgM，提示抗-HEV IgA可以指示排毒。而且有些急性感染的患者沒有ALT的升高，會有短期的病毒血癥，抗-HEV IgG陽性，抗-HEV IgM陰性，卻可以檢測到抗-HEV IgA陽性，類似情況在脊髓灰質炎病毒、漢坦病毒引起的病例中也有過相關報道[14-15]。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指標，可代替或輔助現有IgM診斷試劑用于HE診斷，既增加了檢測特異性，又能有效減少漏診[19-21]。
2 抗-HEV IgA的檢測方法 2.1 蛋白印跡試驗檢測抗-HEV IgA 有文獻報道用蛋白印跡試驗檢測抗-HEV IgA[22]，這種方法具有靈敏度高、特異性好的特點，可用作HE患者的確證試驗。但這種方法操作復雜，耗時較長，影響因素較多，不適合在臨床上廣泛開展。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗-HEV IgA的方法，具有靈敏、快速、操作簡便、費用較低的優點，操作中可用較少的人力快速處理大批量血清標本，檢測結果既可直接用肉眼定性判斷，也可借助酶標儀精確定量讀數，數據重復性好，結果客觀可靠，還可借助全自動酶免分析儀使操作過程實現自動化、標準化，適合臨床常規檢測，是目前HE實驗室輔助診斷方法的研究熱點。 2.2 HEV IgA間接法ELISA 目前文獻報道檢測抗-HEV IgA多用間接法ELISA，其原理是將用已包被抗原與特異性IgM、IgG、IgA結合，由于患者血清中存在大量的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM與抗-HEV IgA競爭結合位點，從而敏感性降低，須通過去除抗-HEV IgG和抗-HEV IgM來提高其敏感性[9]。同時因間接法所包被抗原采用基因1型或2型HEV重組蛋白或合成肽抗原，有研究表明，用第1、2基因型多肽做抗原對檢測第3和4基因型感染患者的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和抗-HEV IgA時，其反應不敏感[23]。最近，Bendall等[13]研究發現，以HEV第1、2基因型抗原建立的ELISA診斷試劑在檢測英國本土HEV第3基因型感染的患者血清時，急性期HEV抗體檢出率可達95%，而半年后檢出率僅為12%。Herremans等[22]則發現以HEV第1、2型抗原檢測HEV第1型感染，檢出率為100%，而檢測第3基因型毒株感染時，檢出率僅為67%(ELISA)和57%(immunoblot assay)。由于HEV具有多基因型的特征，不同基因型抗原和感染不同基因型HEV患者血清反應時會出現抗原抗體結合的差異，這是導致一些檢測方法漏檢的主要原因。因此建立高靈敏度和特異性的ELISA檢測方法需要使用具有廣泛反應性的抗原，尤其是對我國這樣存在多基因型HEV感染的國家以及地區進行臨床診斷和流行病學篩查[4]。 3 抗-HEV IgA檢測需要解決的問題 抗-HEV IgA抗體被證實在HEV急性感染期升高，可以作為早期診斷的標志，已經越來越被認可和重視。目前國內外還沒有抗-HEV IgA診斷試劑盒正式上市，雖然檢測抗-HEV IgA方法已經有了很大的進展，但還存在很多問題：①因各種檢測方法采用的抗原不盡相同，因此敏感性差。最早對HEV的研究表明，HEV基因型按地理位置分布，一個地方只存在一種基因型，但是隨著新的HEV毒株不斷被發現，同一個地區可以存在兩種及以上的基因型。隨著與經濟發展相適應的全球人員流動性的增加以及HEV研究的深入，HEV基因型的地域分布特征已經并將繼續發生重要改變。這種情況下，使用多基因型混合抗原建立酶聯免疫檢測方法，可以大大減少漏診率。②因為抗IgA與IgA不同片段結合位點的差異，導致檢測方法的敏感性也會有較大差異，選擇與IgA反應性高的抗IgA單克隆抗體，可提高抗-HEV IgA檢測的敏感性和特異性[17]。③IgA可以從黏膜中分泌，故如能取唾液進行檢測，不僅方便而且減輕患者痛苦，值得進一步研究。④在免疫球蛋白缺乏癥患者中，HEV近期感染者其抗-HEV IgA可能表現為陰性。⑤通過血液傳播的患者可逃避黏膜免疫，IgA很低甚至沒有。 4 抗-HEV IgA檢測前景展望
目前，對抗-HEV IgA的診斷價值也越來越重視，研制具有高特異性和敏感性的診斷試劑盒具有十分重要的意義。目前IgA類抗體檢測方法除了蛋白印跡試驗檢測，間接法ELISA外，捕獲法ELISA也有較好應用，如冠狀病毒、脊髓灰質炎病毒等的IgA抗體的檢測[14-24]。其原理是首先將高特異性的抗人IgA α鏈McAb包被于微孔板，專一地捕獲血清中的IgA，不與IgM、IgG或其他種類的免疫球蛋白結合，然后抗原特異性IgA抗體與酶標抗原結合，再加入底物液顯色。目前IgA捕獲法ELISA在HEV抗體檢測中還沒有相關報道，但張蘭芳等[25]已成功建立了基于多基因型HEV混合抗原的IgM抗體捕獲法ELISA。該法與間接法ELISA相比，前者陰性本底很低，陰性和陽性結果區別更加明顯，便于結果的判斷，所用的酶標抗原是不同基因型和亞型混合抗原，抗原性穩定，共同抗原表位在不同基因型之間可誘發交叉中和反應，能檢測出來源于不同國家和地區的血清標本，具有較為廣泛的血清反應性，漏檢的機會少，敏感性高。HEV IgM捕獲法ELISA的建立及其他病毒IgA抗體捕獲法ELISA的建立為HEV IgA捕獲法ELISA的建立奠定了基礎。
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