實驗概要
本實驗介紹了總RNA分離純化標準操作規程(SOP)。
實驗原理
氯仿是分子量比較大的有機溶劑，在提取RNA時，氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離。DNA提取過程有機相中主要是酚和蛋白結合，從而使得蛋白和DNA脫離，DNA進入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離，否則DNA會釋放到水相。不管有酚也好，沒有酚也好，氯仿本身也對蛋白有變性作用，劇烈的震蕩，很容易使得DNA的親水基團，與水相接觸。所以不要劇烈震蕩。
異丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團受到保護，等同于沉淀，但是這是個反應時發生在水相中，與前面的氯仿不矛盾。
氯仿的作用有多個方面，一是作為有機溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去，同時也通過變性作用抑制RNase活性；二是RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配試劑提的方法也用苯酚，抽提蛋白時也會用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會損傷核酸，需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除雜作用。
主要試劑
1. Trizol試劑（購自Invitrogen公司）
2. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)
3. 氯仿（新開封）
4. 異丙醇（新開封）
5. 無RNase滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（250℃ 3小時）裝蒸餾水，然后加入0.1%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
6. 75%乙醇：用DEPC處理后的水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于4℃冰箱。
主要設備
1. 研缽
2. 恒溫水浴鍋
3. 旋渦振蕩器
4. 冷凍臺式高速離心機
5. 超低溫冰箱
6. 紫外檢測儀
7. 電泳儀
8. 電泳槽
實驗步驟
1. 勻漿
1) 從組織中提取總RNA、
a. 液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg組織加入1ml Trizol，轉入離心管進行下步操作。
b. 勻漿：用電動勻漿器充分勻漿1~2min。注意，組織樣品體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好。
2) 從培養細胞中提取總RNA
a. 粘壁培養細胞：不需蛋白酶消化，先將培養基去除，然后直接將Trizol加入到培養瓶中消化、裂解細胞，Trizol體積按250px2/ml的比例加入。
b. 懸浮培養細胞：直接離心收集細胞后用Trizol重懸、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106個動物、植物或酵母細胞，或1×107個細菌細胞。注意，在加入Trizol之前不能用其他緩沖液洗滌細胞，那樣會增加 mRNA降解的可能性。另外，在裂解酵母或細菌細胞時可以借助勻漿器。
2. 相分離
1) 勻漿組織加入Trizol后，室溫放置 5min，使其充分裂解。注意：此時可以放入-70℃長期保存。
2) 室溫，12000 r/min，離心5 min。取上清于一新管。
3) 按照1ml Trizol加入200μl氯仿，用手振蕩混勻后室溫放置2~3 min。注意：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。
4) 4℃，12000 r/min，離心15 min。小心吸取上層水相于一新管。注意：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質，則保留下層酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，則棄下層酚相。
3. RNA沉淀
1) 按照1ml Trizol加入異丙醇0.5 ml，混勻，室溫放置5~10 min。
2) 4℃，12000 r/min，離心15min。棄上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在離心之前是不可見的，常常在離心管的邊緣或者底部形成凝膠狀小球。
4. RNA洗滌
1) 按照1ml Trizol加入1ml 75%乙醇，震蕩離心管，懸浮、洗滌沉淀。
2) 4℃，8000 r/min，離心5 min。盡量去除上清。
3) 室溫晾干，或者真空干燥5~10 min。注意：RNA沉淀不要過于干燥，否則將會降低它的溶解度。
5. RNA溶解
1) 用50μl ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS溶解RNA沉淀，然后于55~60℃溫育5~10 min。注意：ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS 均必須用DEPC處理并高壓滅菌；另外，如果RNA后面要用于限制性內切酶分析，則不能用0.5% SDS 溶解。
6. RNA質量檢測
1) 完整性：瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。Trizol試劑可以很容易地分離所有種類的RNA。例如利用Trizol分離老鼠肝臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在7~15kb處，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不連續的帶狀分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有兩條主要條帶，而在0.2kb處則是小分子RNA（tRNA和5S）。
2) 純度分析：計算A260/A280的比率。利用Trizol試劑提取的RNA，其A260/A280比率為1.6~1.8，如果用TE溶解，則A260 /A280大于1.8。
3) 濃度和產量分析：測OD值，定量RNA濃度，計算產量。
注意事項
1. 塑料制品的處理
盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已經標明RNase-Free的塑料制品，如果沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對于國產塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下：
1) 在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物質，活性很強，應在通風櫥中小心使用。
2) 將需要處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3) 在通分櫥中室溫處理過夜。
4) 將DEPC水溶液小心倒入廢液瓶中，用鋁箔封住含有已用DEPC水處理過的塑料制品的容器，高溫高壓蒸汽滅菌至少30 min。
5) 在烘箱中用合適的溫度烘烤至干燥。置于干凈處備用。
2. 玻璃和金屬制品
先用去離子水將器皿清洗干凈，晾干，用鋁箔包好，然后至烘箱中250℃烘烤3 小時以上。