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    發布時間:2022-11-14 16:04 原文鏈接: 怎么通過QPCR的擴增曲線和溶解曲線來分析結果

    1、擴增曲線(如果做雙ΔCT法):

    (1)擴增曲線必須是S型,有明顯的四個時期,且復孔的CT值盡量一致,相差不要超過0.5個CT值(上限是1個CT值);

    (2)同一個基因在不同濃度的相同模板下擴增,其相差的CT值為相差濃度倍數的2次開方。當然這是理論值;另外陰性對照不能有擴增(40個循環以后出CT值屬正常現象,也可算作沒有擴增)。

    2、溶解曲線:

    (1)溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線,顧名思義,其跟模板(或其濃度)沒有關系,擴增什么基因就應該有其相對應的溶解曲線;

    (2)一般SYBR法的目的基因在80~90℃之間;

    (3)出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體(一般為60~75℃之間)視引物長度而定,而基因組DNA污染的峰會在90℃以后。出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因所致;

    (4)基因組DNA那么考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gDNA的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板污染,注意實驗操作等避免模板污染。

    3、溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性的,要是溶解曲線是單峰說明產物只有一條,結果較好;要是雙峰說明產物不特異,可能存在引物二聚體或非特異性擴增,有可能引物設計有問題。


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