選擇引物的一般規則
設計和選擇引物時有5個要素必需注意。
1 引物的3′末端不互補 引物的3′末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產物，極大地減少所期望產物的得量。有實驗表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在－6時只有40%，到－8時少于20%，而－10時，接近于0。雖然產量還取決于其他參數，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由于它的工作能力很強，能夠在很短的時間內就識別3′末端互補的雙鏈區并發動聚合反應，即使3′末端雙鏈的穩定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時產量對二聚體的形成就有很大的依賴性。
2 引物分子內不互補 應當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內雙鏈結構的寡核苷酸。雖然有些帶有發夾環，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5′末端對反應就沒有多大的影響了。
3 引物的組分、解鏈溫度和長度 普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81% AT的引物可以產生單一的，專一的，長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板與穩定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產物長度等于或小于500 bp，選用短的(16～18 mer)的引物：若產物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的產物。但是，引物較長時，如果不借助引物選擇的計算機軟件幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發而不是延伸模板，得出非專一產物。
4 引物的內部穩定性 在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。這就是基于引物內部穩定性的經驗之談。其3′末端穩定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩定程度還不足以引發DNA合成，所以不會產生假產物。因此，為了有效地引發反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發反應，產生非專一產物。如果用3′末端低穩定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。還要注意的是PCR反應產物的質量還取決于模板(底物的復雜性、Tm、產物長度)和退火的溫度與時間。所以，有時3′末端穩定的引物也可以滿意地進行反應。但是，無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個核苷酸的穩定性小于－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩定，假引發的可能性越低。
5 引物的唯一性 為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列。雖然不會整個引物序列都偏好于和模板中的一個以上位點匹配，但是，通常見到的引物的3′末端往往都有6～7個沒有什么個性的核苷酸。如果假引發的位點正好在放大區的內部，那麻煩就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或雜交效率，就容易產生非專一產物。如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應當避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(如—ATATAT—)。