微量熱技術(Microcalorimetry)

微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要結構生物學方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續和準確地監測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位(in situ)、在線(on-line)和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息。 
微量熱法具有以下特點： 
1.它不干擾蛋白質和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優勢，即對被研究蛋白質和核酸體系的溶劑性質、光譜性質和電學性質等沒有任何限制條件。 
2.樣品用量小,方法靈敏度高，測量時不需要制成透明清澈的溶液。 
3.量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行后續生化分析。 
4.微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質和核酸本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結果，這有助于發現新現象和新規律。 
微量熱法在生物大分子研究中的應用主要有： 
1.酶促反應 
2. 蛋白質去折疊/折疊 
3.抗原-抗體相互作用 
4.分子伴侶-底物相互作用 
5.藥物-核酸相互作用

等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） 
實驗是通過滴定反應物到含有反應所必須的另一反應物的樣品溶液中。每次滴定后，反應熱放出或吸收，這些都可以被ITC所檢測到。檢測到的熱效應的熱力學分析提供了結合反應相關的能量過程的定量特征，可以直接測量與常溫下發生的反應過程相關的能量學參數。

1  ITC的特點 
ITC能測量到的熱效應最低可達125 nJ，最小可檢測熱功率2 nW，生物樣品最小用量0.4 μg，而且這些年來ITC的靈敏度得到了提高，降低了響應時間（小于10 s）。ITC不需要固定或改變反應物，因為結合熱的產生是自發的。 
獲得物質相互作用完整的熱力學數據包括結合常數（Ka）、結合位點數（n），結合焓（△H）、恒壓熱容（△Cp）和動力學數據（如酶促反應的K_m和k_cat）。 
ITC也比那些選擇分析方式（如分析型超速離心法，AUC）快，一個單純的AUC實驗需要幾個小時甚至幾天去完成，而典型的ITC實驗只需30~60分鐘，在加上幾分鐘的響應時間。整個實驗有計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數（溫度、注射次數、注射量等）計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟件分析ITC得到的數據。其精確度高以及操作簡單。

 ITC 獲取的結果示意圖 
上圖：峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量。  
下圖：以產生或吸收的總熱量為縱坐標，以加入杯中的兩反應物之摩爾比為橫坐標作圖，可得整個反應過程的結合等溫曲線。

2  ITC的應用 
1）蛋白質-小分子和酶-抑制物相互作用； 
2）蛋白質-糖類相互作用； 
3）蛋白質-蛋白質相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人細胞RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙酰基轉移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本Kanagawa科學技術研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小結構域識別的DNA結構及CBFβ控制的構象調整，闡明了CBFβ與CBFα間的相互作用模式及前者調控后者結合到DNA上的機制(Tahirov, et al., 2001)。 
3）蛋白質-脂質相互作用； 
4）脂質間以及脂質-小分子相互作用； 
5）核酸-小分子相互作用； 
6）蛋白質-核酸相互作用； 
7）核酸-核酸相互作用； 
8）抗體研究：美國Johns Hopkins大學生物系的生物量熱學中心是目前世界上從事生物量熱學最活躍和處于領先水平的實驗室，該中心的Freire小組(Murphy et al., 1993, 1995)應用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導去折疊細胞色素c與其單克隆抗體的結合，發現上述結合過程均為焓和熵同時驅動的反應，實驗結果表明，這些過程中溶劑釋放所導致的熵增過量補償了因結合而引起的構象熵的損失。 
9）受體相互作用； 
10）蛋白質折疊和穩定性：如美國的Wright小組應用ITC和核磁共振(NMR)等技術研究了核激素受體蛋白的一個結構域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學，發現雖然分開的結構域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅動的，并以一種獨特的協同折疊的機制形成螺旋異二聚體。 
11）酶分析：如Freire小組應用等溫滴定微量熱法(ITC)結合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和分光光度法研究了酵母細胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物—亞鐵細胞色素c的熱力學和動力學，并分析了原鹽效應對該酶活性的影響。我們應用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應體系，獲得了這些酶促反應的各種熱力學和動力學信息,探討了相關催化機理，同時用該法研究了博萊霉素催化切割DNA的反應，從熱力學和動力學的角度嚴格地證明了博萊霉素在催化機制上類似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉磷酸化反應的熱力學，從熱力學的觀點確定了該酶促反應為快速平衡的隨機順序反應，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法—微量熱測活法。 
值得指出的是，ITC不僅被應用于研究蛋白質折疊/去折疊，而且被應用于核酸折疊，例如英國的Hammann等人利用ITC研究了鎂離子誘導錘頭狀核酶折疊的熱力學，發現鎂離子與天然序列核酶的結合是一個強烈的放熱反應，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結合有很大的區別，這些工作對于核酸折疊的熱力學研究是良好的開端。

ITC 應用示例

1  ITC法測量結合/解離常數 
Christian Herrmann等運用ITC研究了Ras與效應物和Cdc42與效應物的相互作用。 
Ras是一種在信號轉導過程中起重要作用的蛋白質。可以向其下游的許多信號轉導途徑輸送細胞內調控信號。Ras在非激活態，與GDP結合，當GDP被GTP取代時被激活，與其效應物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈現更緊密的結合。Cdc42是一種GTPase，也是信號轉導相關的蛋白。它參與細胞增殖調控和肌動蛋白細胞骨架的調控。Cdc42在參與細胞骨架調控的過程中，很重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。Ras及其效應物（Raf，RalGDS）的結合方式都很類似，包括富含親水氨基酸側鏈的反平行?－折疊。Cdc42及其效應物(WASP)的結合區則富含疏水氨基酸，其復合物也比Ras/效應物復合物大得多。

ITC可以直接測量焓變△H，結合常數K_a，而不對反應體系產生影響，也不引入修飾基團，因此測得的結果更加可信。

圖18-7  實驗結果：20℃時GCN4-D和GCN4-M與AP-1的滴定反應和擬合曲線
(a) GCN4-D滴定AP-1；(b) GCN-M滴定AP-1
這里是以獨立結合位點模型進行最小二乘法擬合計算出了結合常數Kb、結合焓變ΔH0和結合計量數N等值（結果見表18-1、2）。

研究結果：
ITC測定的反應熱既包含結合反應又包含折疊反應。肽與DNA結合過程伴隨著肽的構象折疊和疏水表面包埋。肽的構象中熵的損失對熵變的不利貢獻大于溶劑效應產生的有利貢獻，由于包埋疏水表面時所引起的結合水的損失對熵變產生有利貢獻，因此肽與DNA結合過程中總的熵變對結合是不利的。
產生熵變的因素有：
1）疏水作用產生的有利貢獻；
2）肽與DNA形成復合物由于轉動和平移自由度的減小引起的熵損失；
3）結合過程中肽與DNA的折疊或其他構象變化產生的不利貢獻。

表18-1  GCN4-D與AP-1和CRE結合的熱力學參數

表18-2  GCN4-D與AP-1和CRE結合的熱力學參數