二、沉淀反應
可溶性抗原(如細菌的培養濾液、含細菌的患者血清、腦脊液及組織浸出液等)與相應抗體相混合，在比例適合和適量電解質的存在等條件下，形成肉眼可見的沉淀物，稱沉淀反應。利用沉淀反應進行血清學試驗的方法稱為沉淀試驗。沉淀反應有環狀、絮狀和瓊脂擴散法3種基本類型。
1．環狀沉淀試驗
將已知的抗血清加于內徑1~3mm，長75mm的玻璃細管中約三分之一高度，然后沿管壁徐徐加入已適當稀釋的待測抗原溶液，使成為分界清晰的二層，置室溫或35℃5~30min后，如在兩液面交界處形成肉眼可見的白色環狀沉淀物為陽性反應。本試驗主要用于鑒定微量抗原，如鏈球菌、肺炎鏈球菌、鼠疫耶爾森菌的鑒定及炭疽的診斷（Ascoli氏試驗）。
絮狀沉淀試驗
指可溶性抗原與抗體在試管內以適當比例混合后，在電解質存在的條件下，出現絮狀的沉淀物。有2種方法：一種是將恒定量的抗體分別與一系列稀釋的抗原溶液在試管內混合，另一種是將恒定量的抗原分別與一系列稀釋的抗血清在試管內混合，隨后觀察各管沉淀物出現的時間和量。通常在抗原與抗體比例最適管，出現沉淀物最快，量最多。本試驗常用于毒素、類毒素、抗毒素的定量測定，還用于已知抗原測血清中的相應抗體，如肥達氏試驗用于診斷傷寒、副傷寒等。
瓊脂擴散試驗
用瓊脂制成固體的凝膠，使抗原和抗體在凝膠中擴散，若兩者比例適當，則在相遇處形成肉眼可見的沉淀物（線或環），為陽性反應。常用的試驗方法有：
(1)單向瓊脂擴散試驗：是將抗體預先在瓊脂中混勻，制成凝膠板，凝固后在瓊脂上打孔，孔中加入待試抗原，經一定時間擴散后，若抗原與抗體對應，則在孔周圍比例適當處形成白色沉淀環。由于沉淀環大小與直徑孔中抗原濃度成正比關系，故可事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，來測定未知標本中抗原含量。本法是一種定量試驗，主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量。
(2)雙向瓊脂擴散試驗：先制備瓊脂凝膠板，待凝固后，根據需要在其上面多少個孔，孔間保持一定距離，然后將抗原和抗體分別注入小孔中，使兩者相互擴散。如抗原與抗體相對應，濃度比例適當，經一定時間擴散后，在抗原抗體孔之間出現清晰的白色沉淀線。一對相應的抗原抗體只能形成一條線。因此，根據沉淀線的數目即可推測抗原液中有多少種抗原成分，根據沉淀線融合與否及交叉關系，還可鑒定兩種抗原是否完全相同，還是部分相同。本法可用于檢測未知抗原或抗體、分析和鑒定抗原成分、檢測抗體或抗原的純度、滴定抗血清的效價等。缺點是需時長，敏感性差。
(3)對流免疫電泳：是一種將雙向擴散和電泳技術相結合的方法。試驗時按雙向擴散法在瓊脂板上打孔，抗原加于陰極側的孔中，抗體加于陽極側的孔中，然后通電，在電場與電滲作用下抗原與抗體向相對方向移動，兩者相遇后即可出現沉淀線。
(4)免疫電泳：是將瓊脂電泳與雙向瓊脂擴散相結合的方法。先將抗原在瓊脂平板上進行電泳，使其中各成分因電泳遷移率不同而分離區帶。爾后沿電泳方向挖一與之平行的槽，加入特異性抗體作雙向瓊脂擴散。各區帶中抗原分別在不同位置與抗體相遇生成弧狀沉淀線。可據沉淀弧的數量、位置和形狀，與已知標準抗原比對，即可分析樣品中的成分及其性質。免疫電泳主要用于血清蛋白的組分分析。亦用于抗原和抗體提純物的純度鑒定。
三、補體結合反應
是一種在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素為指示系統的抗原抗體反應。在試驗時，先將定量補體（使用新鮮的豚鼠血清）加入待檢系統中，使抗原抗體優先結合補體。如果待檢系統中抗原與抗體相對應，加入的補體可被抗原抗體復合物所結合而固定，不再與以后加入的溶血系統起反應，不出現溶血現象，為補體結合反應陽性。如待檢系統中的抗原抗體不相對應，則游離的補體與后面加入的溶血系統反應，從而出現溶血，為補體結合反應陰性。如果待檢系統中抗原抗體比例不適當時，仍有部分補體游離，則此剩余的游離補體可作用于溶血系統產生不同程度的溶血現象，據此可判斷陽性反應的強弱，推知抗原或抗體的效價。
本反應可用已知抗原測定未知抗體，也可用已知抗體測未知抗原。多用于檢測某些病毒、立克次體和螺旋體病病人血清中的抗體。亦用于某些病毒分型試驗。
四、莢膜腫脹試驗
1．原理
特異性抗血清與相應細菌的莢膜抗原特異性結合形成復合物時，可使細菌莢膜顯著增大出現腫脹。
2．方法
取潔凈載玻片一張，兩側各加待檢菌1~2接種環，于一側加抗血清，另一側加正常兔血清各1~2接種環，混勻；再于兩側各加1％亞甲藍(美藍)水溶液1接種環，混勻，分別加蓋玻片，置濕盒中室溫放置5~10min后鏡檢。
3.結果
若試驗側在藍色細菌周圍可見厚薄不等、邊界清晰的無色環狀物而對照側無此現象，為莢膜腫脹試驗陽性；試驗側與對照側均不產生無色環狀物則為莢膜腫脹試驗陰性。
4. ．應用
常用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和炭疽芽胞梭菌等檢測。
五、制動試驗
原理
特異性抗鞭毛血清與相應運動活潑的細菌懸液混合，則抗鞭毛抗體與鞭毛抗原結合，使鞭毛強直、相互粘著而失去動力，細菌運動停止。
方法
將待檢標本或增菌培養液1滴置于潔凈玻片上，用顯微鏡觀察細菌運動情況。再于待檢標本上加 l滴適當稀釋的特異的抗鞭毛血清，混勻，作懸滴鏡檢。
結果
若滴加抗血清后3~5min內，細菌運動停止，菌體凝集成塊為制動試驗陽性；反之，滴加抗血清后，細菌運動無改變為制動試驗陰性。
應用
主要用于霍亂弧菌的快速鑒定。
第五節 分子生物學技術在微生物檢驗中的應用
分子生物學技術的迅速發展，拓展了微生物學檢驗方面的應用空間。該技術具有敏感、特異、安全和快速等特點，在微生物檢驗中發揮著日益重要的作用。本節簡要介紹分子生物學技術在微生物檢驗中的應用，具體檢測方法參見有關專著或試劑盒說明書。
一、分子生物學技術在細菌分類中的應用
細菌的傳統分類法和數值分類法以表型特征相似性為基礎，而單純表型相似性還不能準確地確定系統發育關系。隨著分子生物學及遺傳學的發展，細菌分類學中發展了一系列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量測定、DNA-DNA雜交、16S rRNA相關度分析等。
DNA分子中G＋C百分含量的測定
細菌DNA
G+C或A+T摩爾百分比能反映細菌間DNA分子同源程度，不同種屬間G+C mol%范圍在25%~ 75%之間，但同一種細菌G+C
mol%相當穩定，不受菌齡、培養條件和其他外界因素影響，親緣關系越近的細菌，G+C
mol%越相近，親緣關系較遠的細菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其親緣關系不一定相近。最常用的測定方法是熱變性溫度法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法。
DNA-DNA雜交
DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。目前最常用的是復性速率法，變性DNA在溶液中復性（雜交）時，同源DNA的復性速率比異源DNA要快，同源性愈高，復性速率愈快。復性的過程也伴隨著260nm紫外吸收的減少，再通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復性速率，最后用理論推導的公式來計算DNA之間的同源性。同一菌的復性率為100%，80%~90%同源為同一種內同一亞種的細菌，60%~70%同源為同一種內不同亞種的細菌，20%~60%同源則是同一屬中的不同菌種。這種方法還可對新菌種或表型性狀差別很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，并可修正其他方法的分類和鑒定錯誤。
3．16S rRNA同源性分析
(1)
rRNA-DNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關，適于細菌屬及屬上水平的分類研究。現最常用的是硝酸纖維膜結合法。
(2)16S
rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長期的進化中，16S
rRNA的總堿基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個或多個寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區域互補的15~20個核苷酸），用反轉錄酶合成反轉錄DNA。隨著PCR技術的成熟，出現了利用PCR技術擴增16S
rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當前的細菌分類要求測定16S
rRNA基因的全序列來進行比較。16S rRNA基因序列分析技術是建立系統分類的主要技術，有人建議DNA相關性≥70%，16S
rRNA序列差異≤1%~1.5%的細菌屬于同一種，這使細菌的種有一個穩定和統一的標準。
二、分子生物學技術在細菌鑒定中的應用
十九世紀，細菌的鑒定主要依靠細菌的表型特征，因耗時長，往往耽誤了對疾病診斷與治療。隨著分子生物學技術的發展及在臨床微生物學檢驗中的應用，為微生物學實驗室對細菌的快速鑒定，尤其是對難分離細菌的快速鑒定，提供了有利條件。目前在細菌鑒定中應用的分子生物學技術主要有核酸探針和核酸擴增技術等。
1．核酸探針技術
應用核酸探針技術檢測病原微生物核酸是臨床診斷學的重大發展，其原理是用帶有酶、化學熒光物、放射性核素或生物素標記的已知序列特定DNA片段（稱為探針），在一定條件下，按堿基互補原則探針與待測標本中的核酸雜交，通過對雜交信號的檢測，從而鑒定標本中有無相應的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術有固相雜交（斑點雜交、原位雜交、Southern印跡、Northern印跡等。）和液相雜交技術。
核酸探針適用于直接檢出臨床標本中的病原微生物，不受非病原微生物的影響，因此對某些尚不能分離培養或很難分離培養的微生物的檢測具有重要的意義。隨著探針標記的不斷改進，檢測試劑盒商品化，操作更簡便易行。
核酸擴增技術
核酸擴增（又稱基因或DNA擴增）技術是體外酶促合成DNA片段的新方法，其原理類似于DNA的體內半保留復制。主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成。即在高溫下（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37~55℃）情況下，兩條人式合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物的3`端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5`
3`方向延伸，合成DNA新鏈。這樣每一雙鏈DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使人工合成的引物間的DNA特異區段拷貝數擴增一倍。經過上述25~40個循環后，靶序列可以擴增成106~108。
核酸擴增技術（或稱聚合酶鏈反應技術，PCR）具有高敏感性、高特異性、簡便、快速等特點，臨床實驗室常用PCR技術來檢測標本中某些微生物，尤其是對難以培養微生物的檢測。其它用于檢測微生物的PCR技術還有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和隨機引物PCR等。核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用見表6-4-2。
表6-4-2 核酸擴增技術在臨床微生物學檢驗中的應用
微生物種類 核酸擴增技術 應 用
金黃色葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
凝固酶陰性葡萄球菌 多重PCR 對mecA基因檢測
肺炎鏈球菌 PCR 自溶酶和青霉素結合酶的檢測
化膿性鏈球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型
淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物標本直接檢測
百日咳桿菌 PCR、巢式PCR 臨床標本檢測
結核分枝桿菌
PCR、SDA、Qbeta 肺結核的診斷、呼吸道標本檢測、臨床標本直接檢測
鳥分枝桿菌復合群 PCR 鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的區別
白喉棒狀桿菌 PCR 產毒菌株的檢測
腸致病性大腸埃希菌 多重PCR 產毒菌株檢測
傷寒、副傷寒沙門菌 PCR 耐藥質粒分型和檢測
幽門螺桿菌 多重PCR 胃活檢組織細菌檢測
小腸結腸炎耶爾森菌 PCR 菌株分型
彎曲菌屬 PCR 通過16s rRNA鑒定
杜克雷嗜血桿菌 多重PCR 生殖道潰瘍病人的直接檢測
嗜肺軍團菌 PCR 與爆發相關菌株的分型
金氏桿菌屬 PCR 臨床標本鑒定
念珠菌屬 PCR 通過“DNA”指紋鑒定
梅毒螺旋體 多重PCR 生殖道潰瘍標本直接檢測
伯氏螺旋體 巢式PCR 治療前、中、后檢測
問號狀鉤端螺旋體 PCR 鉤端螺旋體血清型的鑒定
CDC group Ⅳ 群 PCR 分型
沙眼衣原體 PCR 無癥狀病人的診斷
三、分子生物學技術在細菌藥敏試驗中的應用
分子生物學技術在檢測耐藥基因方面日益受到重視。臨床上可用PCR方法檢測耐藥基因，來判斷待檢菌對某種抗菌藥物是否具有耐藥性。但某些沉默耐藥基因，如不表達相應產物，則可能不表現耐藥表型。現在已有檢測耐藥基因的DNA探針和PCR商品化試劑盒供應，但多用于實驗研究，常規工作中開展較少。目前能檢測的耐藥基因有：
β-內酰胺類
mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。
氨基糖苷類
aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3）
-Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。
氯霉素
catP、catQ、catD、catI
環內酯類
ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。
磺胺類
sulⅠ、sulⅡ,sulA。
四環素
tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。
甲氧芐啶
dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。
8．糖肽類
vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。
9．喹諾酮類
gyrA、gyrB、parE。
10．乙胺丁醇
embB。
11．吡嗪酰胺
pncA。
12．利福平
rpoB。
13．鏈霉素
rpsL、rrs。
14．異煙肼
katG、inhA、ahpC。