張鋒連發Science，Nature文章：CRISPR下個技術趨勢—RNA編輯

　　10月25日Science發表了CRISPR技術先驅張鋒研究組的最新成果：RNA editing with CRISPR-Cas13，咋一看這個標題還以為是張鋒一稿多投，因為實在是與本月初他們研究組發表在Nature的論文標題太像了（Nature論文：RNA targeting with CRISPR–Cas13）。這兩篇論文聚焦的都是CRISPR的另外一大技術應用：RNA靶向編輯。

　　將RNA編輯酶融合到靶向RNA的Cas蛋白中，這樣研究人員就能編輯人體細胞中特定的核苷酸了，張鋒研究組將這種方法稱為RNA Editing for Programmable A-to-I replacement (REPAIR), 這一技術不僅可以用作研究工具，而且可作為由突變引發的疾病的臨時治療方法。

　　來自哈佛大學的化學生物學家David Liu（未參與該項研究）點評道：“這項工作是一個非常有成效，令人令人印象深刻的研究成果，它提出了編輯RNA轉錄本。從而以編程的方式改變其編碼的潛力可能性。對于通過靶標RNA序列的暫時變化達到最好解決問題的應用，這種方法具有很強的潛力”。在同期Nature雜志上，Liu也報道了一種類似的編輯DNA特異性核苷酸的方法

　　靶向RNA

　　CRISPR這一明星技術在基因組DNA編輯方面發揮了許多重要的作用，雖然其主要應用于DNA，但一些新的研究已將它的范圍擴展至RNA編輯。去年Nature Methods評選出的年度技術中就有將革命性的CRISPR基因編輯技術用來靶向RNA，其中的一大進展就是麻省理工張鋒研究組關于能夠靶向和降解RNA的一種RNA引導酶——C2c2（也被稱為Cas13a）功能特征的研究。

　　在此基礎上，張鋒研究組在10月5日Nature雜志上又公布一項成果，證實了切割RNA的Cas13a酶能夠特異性地降低哺乳動物細胞中的內源性RNA和報告RNA水平。并指出這種方法比RNA干擾（RNAi）的效率更高，能被用于抑制細胞RNA靶標，結合和富集感興趣的RNA，以及通過序列特異結合對細胞內的RNA進行成像。

　　研究人員發現切割RNA的Cas13a酶，能夠特異性地降低哺乳動物細胞中的內源性RNA和報告RNA水平。而且他們也指出與在細菌中不同的是，Cas13a在人細胞系中，僅僅只是靶向gRNA指定的RNA，細胞中所有其它的RNA保持完整。他們分離得到了Leptotrichia wadei的Cas13a酶，構建出了一種雙質粒RNA靶向CRISPR系統，這一系統能在不同的質粒上表達導向RNA（gRNA）和Cas13a基因，其中Cas13a基因含有一種經過改造的核定位序列。在人細胞系中，這種CRISPR-Cas13a系統能高效地切割報告質粒中轉錄的RNA和三種內源性基因轉錄的RNA。

　　在CRISPR出現之前，RNAi是調節基因表達的理想方法。但是Cas13a一大優勢就在于其具有更強的特異性，而且這種本身來自細菌的系統對哺乳動物細胞來說，并不是內源性的，因此不太可能干擾細胞中天然的轉錄。相反，RNAi利用內源性機制進行基因敲除，對本身的影響較大。

　　RNA編輯

　　雖然人體很多疾病是來自于DNA，但是由于基因承載著生命最根源的信息，因此直接對DNA進行編輯會出現安全和倫理上的問題。而RNA編輯卻不同，通過編輯RNA能暫時性的糾正DNA翻譯的信息，讓蛋白質接收到正確的信息，達到治療的效果，這可能是更加有效的一種臨床應用方式。

　　在這項最新研究中，張鋒研究組的一名成員Omar Abudayyeh就對此產生了興趣，他提出了問題：“我們還能利用Cas13酶做什么？”他的一個想法是通過蛋白質的RNA靶向能力來召集RNA編輯酶，從而能在特定部位進行確定的核苷酸編輯。

　　RNA編輯是轉錄進程中的一種形式，其中涉及核苷酸替換的酶調控。最主要的RNA編輯是A(adenosine)-to-I(Inosine) 的修飾，這個過程受到蛋白酶ADAR（adenosine deaminases that act on RNA )的催化調控。

　　張鋒研究組構建了一種新型融合蛋白，即將ADAR的催化結構域和Cas13b的一個催化內含子拼接在一起，這一蛋白具有靶向人體細胞中任何靶標RNA的能力，張鋒等人將其稱為REPAIR。REPAIR具有安全性和靈活性兩大特征，無需修改基因組就能修復突變，而且RNA會自動降解，因此對它的修改或是可逆的。

　　羅切斯特大學的RNA生物學家Mitchell O'Connell（未參與該項研究）表示，“在治療上，對于某些遺傳疾病，編輯基因組，永久性地固定一種突變也許更合適，但對于需要基因表達短期變化的疾病來說，RNA編輯可能更有效。”

　　在此基礎上，研究人員還對REPAIR進行了優化，令其在轉錄組中可檢測到的脫靶次數從1.8萬次降至20次。這一編輯器對靶標RNA的編輯效率為20%-40%，最高甚至可以達到51%。

　　為了驗證REPAIR的作用，研究人員將其應用于恢復兩種疾病相關的G-A突變，一種是糖尿病，另一種是Fanconi貧血癥。他們將REPAIR引入到細胞中，結果證實REPAIR可以在RNA水平上修復致病突變。

　　目前研究人員還在進一步探索這一工具的使用，來自美國國家生物技術信息中心的計算生物學家Eugene Koonin（未參與該項研究）表示，“這篇文章只是一個開端，”Cas13b可能可以融合到多種編輯酶上，這些酶也許能用于一系列不同的序列變化。