張鋒參與發表CRISPR新研究成果

　　2016年7月29日，國際學術期刊《Journal of Biological Chemistry》在線發表了哈佛大學醫學院、麻省理工學院-哈佛大學Broad研究所和山西眼科醫院等處的一項最新研究成果，題為“The Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats-associated Endonuclease 9 (CRISPR/Cas9)-created MDM2 T309G Mutation Enhances Vitreous-induced Expression of MDM2 and Proliferation and Survival of Cells”，哈佛大學醫學院眼科系Schepens眼科研究所的Hetian Lei博士是本文通訊作者，CRISPR/Cas9技術的先驅開創者之一、Broad研究所的張鋒（Feng Zhang）博士以及山西省眼科醫院的段雅劍（Yajian Duan）博士也是本文共同作者。

　　增生性玻璃體視網膜病變（Proliferative vitreoretinopathy，PVR）是一種威脅視力的疾病，是由孔源性視網膜脫離（RRD）以及開放性眼外傷的手術矯正引起的，其特征是形成視網膜前膜（ERMs）。ERMs是由細胞外基質蛋白和細胞（包括視網膜色素細胞、視黃醛細胞、纖維母細胞和巨噬細胞）組成。PVR發生在8%到10%接受RRD手術修復的患者當中，并占術后所有原發性故障的大約75%。

　　致癌基因蛋白MDM2是一個泛素蛋白連接酶，其人類同源物（也叫HDM2）是p53腫瘤抑 制因子的一個重要的負調節因子；MDM2無效的胚胎小鼠致死表型，可以通過敲除p53基因而被阻止。實驗兔的玻璃體優先激活血小板衍生生長因子受體 α（PDGFRα）。這種激活轉而會啟動磷酸肌醇3激酶（PI3K）/ Akt下游的信號通路，從而提高p53的降解。用小分子Nutlin-3阻斷MDM2 與p53結合，可在PVR家兔動物模型中保護家兔免于視網膜脫離。

　　有趣的是，在MDM2啟動子位點中的單核苷酸多態性（SNPs）（rs2279744）的 G等位基因，隨后被發現與RRD患者較高的PVR風險相關。這個SNP還與致癌風險增加相關。MDM2第一內含子啟動子位點上的SNP T309G（在第309個核苷酸的一個T到G的變化），可增強轉錄激活因子特異性蛋白（Sp）1的親和力，從而導致MDM2的表達升高，以及隨后p53在 腫瘤細胞中的表達減弱。然而，這個SNP是否有助于PVR的發病機理，仍有待于探索。

　　細菌和古細菌中的CRISPR和CRISPR相關核酸酶（Cas），提供了適應性免疫力對抗病毒和質粒，它們的CRISPR RNAs（crRNAs）被用來指導外來核酸的Cas裂解。在化膿性鏈球菌（Sp）中，Cas9（SpCas9）包含兩個核酸酶結構域——RuvC和 HNH，當被crRNA和tracrRNA引導時，每個能裂解雙鏈靶DNA的一條鏈。這個SpCas9可以被重編程為使用處理后的sgRNAs（由 crRNA和tracrRNA組成）靶定哺乳動物細胞中特定的基因組位點。

　　CRISPR/Cas9產生的特定基因組位點上的DNA雙鏈斷裂（DSBs），可以通過內 源性修復機制——非同源末端連接（NHEJ）和同源性修復（HDR），而得以修復，這取決于細胞狀態和一個修復模板的存在。NHEJ和HDR是細胞中兩種 截然不同的修復途徑。NHEJ能夠引入不可預知的插入和缺失（indel），它可以通過簡單地再連接兩個DSB末端，而修復病變；HDR可以使用一個外源 性的單或雙鏈DNA模板——具有預期的變化，在基因位點產生突變。然而，與NHEJ相比，HDR不常使用，因為它只發生在S和G2期，而NHEJ可以發生 在整個細胞周期。最近，CRISPR/Cas9技術被用于真核細胞和小鼠的各種基因組編輯應用中，它提供了一個獨特的機會來證明“MDM2 和T309G是否有助于PVR的發病機制”。

　　在這項研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9技術，在人類原發性視網膜色素（hPRPE） 細胞中的MDM2基因組位點產生了T309G突變。研究人員利用雙腺相關的病毒衍生載體，將SpCas9和引導RNAs，連同一個同源修復模板，傳遞到靶 向MDM2基因組位點，以在人類原發性視網膜色素上皮細胞（其基因型是MDM2 T309T）中產生MDM2 T309G突變。

　　新一代測序結果表明，利用腺相關病毒CRISPR/Cas9編輯過的hPRPE細胞中，有42.51%的MDM2 G309。這些數據表明，玻璃體可誘導MDM2的表達增加，以及隨后p53在MDM2 T309G hPRPE細胞中的表達減弱。此外，這些實驗結果表明，hPRPE細胞中的MDM2 T309G可增強玻璃體誘導的細胞增殖和存活，從而表明這一SNP有助于PVR的發病機制。