實驗材料 T4 多核苷酸激酶AMV 反轉錄酶酵母 tRNA
試劑、試劑盒 10X 激酶緩沖液 5X 雜交緩沖溶液 Tris-HCl MgCl2 DTT 放線菌酮 D dNTP RNasin 甲酰胺上樣染液 SephadexG-25 NaAc 乙醇 [r-32P]ATP
儀器、耗材 水浴 雜交爐 電泳設備
實驗步驟
一、材料與設備
1) 水浴
2) 雜交爐
3) 電泳設備
4)T4 多核苷酸激酶，AMV 反轉錄酶
5)10X 激酶緩沖液：5mol/LTris-HCl(pH7.6)，0.lmol/LMgCL2，50 mmol/LDTT，lmmol/L 亞精胺.1 mmol/LEDTA
6)5X 雜交緩沖溶液；2 mmol/LNaCl,50 mmol/LPTPES(pH6.4)
7)1X 延伸溶液：
lmol/LTris-HCl(pH8.3) 10ul
120 mmol/LMgCl2 10ul
200 mmol/LDTT 10ul
1 mg/ml 放線菌酮 D 5ul
lOmmol/LdNTP 10ul
RNasin 40U 1ul
加水至 I78ul
8) 甲酰胺上樣染液：80% 去離子甲酰胺，45 mmol/LTris-HCl(pH8.3)，45 mmol/L 硼酸，1.25 mmol/LEDTA，0.02% 二甲苯青
9)SephadexG-25, 用約 50 倍體積的 TE[10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.0 mmol/LEDTA] 重懸 SephadexG-25, 高壓滅菌 15 min，冷卻后存于 4℃
10) 酵母 tRNA: 濃度為 25 mg/ml，用 DEPC 水配制，注意避免 RNase 的污染，保存于塑料瓶中，存于一 20℃
11)3mol/LNaAc
12)70% 乙醇：用 DEPC 水配制
13)[r-32P]ATP
二、操作方法
(一）用 T4 多聚核苷酸激酶放射性標記引物
1) 將引物溶于水或 TE 緩沖液中，終濃度為 0.4ug/ul，再依次加人下列組分:
引物 1?5pmol(0.4ug)
10X 激酶緩沖液 1ul
[γ-32P]ATP 35uCi(3000Ci/mmolL)
T4 多聚核苷酸激酶 20U
DEPC 水補足 10ul
2) 混合并于 37℃ 溫育 0.5?lh，加入 250 mmol/LEDTA 終止反應
3) 用 TE 將總體積加至 100ul。通過 SephadexG-25 柱將未標記的引物從激酶化的引物中分離出來，收集第一個放射活性峰，65℃ 溫育 l0 min 以滅活了 T4 多聚核苷酸激酶
4) 用等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24:1) 抽提，向水相中加入 NaAc 和 MgCl2 至終濃度分別為 0.3mol/L 和 5 mmol/L, 并加入 lOugtRNA。加入 2.5 倍體積的無水乙醇. 放在干冰中 10 min，12000 g 4℃ 離心 30 min, 用 70% 的乙醇離心洗滌沉淀. 將沉淀干燥并重溶于 80ul 無菌水中
(二）雜交
1) 在微量管中，混合下列組分：
靶 RNA 0.1?5fmol(最多為 20ug 的總 RNA)
SX 雜交緩沖液 4ul
標記的引物 1?50fmol
加水至 20ul
2) 于 70℃，溫育 3 min
3) 在 54℃ 雜交 1.5?4 h
(三) 延伸反應
1) 樣品屮加入 178ul 延伸緩沖液，置與冰上
2) 加入 lul RNasin 和 1ul 反轉錄酶,42°C: 保溫 lh
3) 加入 20ul 和 2.5 倍體積的無水乙醇，在干冰中放置 10 min,12000g 離心 15 min, 用 70% 乙醇離心洗滌，空氣干燥 2 min
4) 用甲酰胺上樣染液重懸沉淀，注意要充分混勻。
5）90℃ 熱變性 3 min, 然后置于冰上
6) 將 8ul 樣品上樣于變性聚丙烯酰胺凝膠，同時加入 DNA 分子質量標準物后進行電泳
注意事項
1) 延伸反應產物的總暈與退火時間的 K 短成正比的增加（退火時間不超過 12 h）若超過 12 h 即使增加退火時間也不顯著增加反應產物總量，因為產物形成中增加的部分會由于非特異性降解而失去
2) 所需總 RNA 的 M 決定于靶 RNA 的濃度，最好通過預試驗以確定出 RNA 的濃度范，從而得到滿意的結果
3) 使用短至 17 個核_ff 酸的引物也很成功，當為引物延伸測定法設汁引物時，其靶序列務必位于 RNA5＇末端的 100 個核苷酸的區域之內，這樣可減少潛在的不均一延伸產物，它們的產生岳由于反轉錄酶在模板 KNA 的一級結構區域里終止或暫停作用造成的。單鏈的寡核苷酸（5＇端未磷酸化）是引物域力便的來源 D 此外，引物也可以從相應的克降的基因通過限制酶消化而獲得。利用一對相距 20?l0 bp 并可產牛. 不同長度的黏性未端的稀有酶切的位點，經酶切后產生不同長度的條編碼鏈和一條非編碼鏈。對兩次切割位點之間的片段作放射性標汜可產生個獨一無二的末端標汜片段，在變忡的內烯酰胺凝膠上. 電泳和放射 D 顯影后町以將其與非編砰鏈分開。兩條鏈的長度相差愈大，限制酶切的片段就愈小. 探針的分離也就愈好。也可用一個獨一無二的末端標記的雙鏈引物. 因為 RNA-DNA 雜合分子比 DNA-DNA 雜合分子更穩定（其最適雜交溫度大約尚 5℃)。不過用雙鏈引物時需精確測定雜交溫度，這就降低了這一技術的效率。理想的情況是引物應標記 5＇端，限制晦切片段的 V 端磷酸必須在激酶處理之前先用堿性磷酸酯酶除去，不過如僅僅用作對某個 mRNA 的定量測定，那么 3＇標記也是可以的。實際應用限制酶所產生的探計可能更為簡單一些（例如，對于產生不同大小的鏈標可能是重要的），采用均勻標記的探針可使引物延仲分析法的靈敏度得到改進。引物離帽位點愈遠，則反轉錄酶的作用在 RNA 二級結構的部位上或在 RMA 降解（例如被 RNase 降解）的部位上過早終止的可能性就愈大，這些不連續的「早熟」的帶他帽位點信號減弱。如將引物的位點移到對延伸存強大阻砑作用的二級結構的 5＇端處，則可以改進帽位產物的得率.
4) 若將標記引物與止在制備的待分析 RNA 先行合，引物與 RNA 便可以共沉淀下來，沉淀可溶于 DEPC 水中，雜交反應所需的其他成分便可直接加入此 S 新懸浮的沉淀中，引物和待分析的 RNA 與雜交緩沖液混合，加熱至 70℃ 破壞 RNA(或引物）的二級結構，然后再進行復性
5) 雜交時引物濃度約為互補的 RNA 摩爾濃度的 10 倍，如果超過太多〔特別是當雜交嚴格度低于最適時）會造成非特異性的啟動。雜交的最適溫度取決于引物的 K 度及其堿基組成。計算 RNA-DNA 雜合分子的解鏈溫度的公式并不適用于計算短鏈的 DNA 引物。大多數探針的解鏈溫度在指定的緩沖液中為 45?65℃。應該用這范圍內的溫度進行小規模的試驗，對專一的引物-mRNA 的結合確定最適雜交溫度&雜交反應進行 3?6 h。在高溫中 RNA 對熱敏感，因此最適雜交溫度高的#物復性時間愈短愈好
6) 檢測雜交效率的一個簡單辦法是對 RNA-以物雜合分子作一個修正的 S1 核苛酸定位試驗。就是將寡核背酸和 RNA 在待確定的雜交溫度范圍內雜交 3?6 h，用 S1 核酸酶消化余合分子，然后在變性的丙烯酰胺凝膠上電泳，測定被保護的（雜交的）寡核苷酸量。產生最大的抗 S1 核酸酶的標記物的溫度應詼用作以正式的雜交反應溫度
7) 應該對目標 mRNA 的用量優化，即通過用不同量的 RNA 制備物進行個典型的雜交反應，這里可以用細胞質總 RNA，不過用poly(A)+ RNA 可以得到靈敏度更髙和更清晰的結果。
8) 核糖核酸酶抑制劑 RNasin 可以用在延伸反應中（1ul，約為 40U)，但在雜交反應中效果較小，因為在保溫會消除二級結構以及在高溫進行的復性反應，這樣都能使 RNasin 的蛋白質變性。此外 RNasin 的活件嚴格依賴于最低量的 1 mmol/L 二硫蘇糖醇，而一硫蘇糖醇在高溫屮也不穩定。延伸反應在 42°C 進行以減少 mRNA 的二級結構的形成，后者可以使反轉錄過早終止, 延伸反應件往在帽鄰近處形成不止一條帶，這可能代表真正的轉錄多起始點，此外，認為如果 mRNA 的帽位上的或鄰接的核苷酸 上 發生甲基化，則可使反轉錄酶的作用在一部分分子中過早終止。在精確測定轉洪起始點時，這些影響都應加以考慮。在不同甩的轉染細胞中的幾種帽位點條帶之間的比例有所不 同，但對一定來源的 mRNA 此比例則保持恒定不變
9) 反轉珙酶催化的 cDNA 冋折合成吋以形成額外的條帶，刼管在延伸緩沖液中加入的放線菌素 D 能夠降低這一活件。焦磷酸鈉（80 mmol/L) 似乎效果更好，但它對某些來源的反轉錄酶忖能有抑制作用。引物與組織培養細胞的內源性 RNA 或與載體 rRNA 之間的交叉有時吋以 W 致出現假帶。從不表達該基因的細胞中分離 RNA 作引物延伸反應并將其作為對照，就可以鑒定出這拽假帶 D