應用PCR技術擴增Hbβ基因

復習細胞內DNA復制條件和過程。

一、目的
1：學習PCR技術的基本原理
2：掌握從全血中制備DNA的方法‘
3：掌握應用PCR擴增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因結構

二、原理
1：PCR擴增的原理
聚合酶鏈反應—PCR是一種體外基因擴增技術，是在引物和四種脫氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反復作用，使微量的特定片段得以大量擴增的反應過程。
PCR所需的條件：模板
引物：決定擴增產物的特異性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg ²⁺
PCR反應過程

每三步為一個循環，每循環一次，使模板DNA拷貝數增加1倍，理論上講，30個循環后，擴增產物為2 ³⁰ 拷貝

本實驗應用PCR技術擴增Hbβ基因上400bp片段
引物序列為 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR產物的鑒定
含溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳
DNA在pH8.0電泳緩沖液環境下帶負電荷，向陽極移動。DNA分子量大小及形狀不同，電泳速度不同。在分子形狀相同的條件下，分子量（bp數）越大，電泳速度越慢；分子量（bp數）越小，電泳速度越快；分子量（bp數）相同，電泳速度相同。所以PCR擴增產物可以根據分子量（bp數）的大小進行分離。bp數相同的DNA集中在同一位置上，與EB結合成復合物，在紫外燈激發下，發出桔紅色的熒光，而形成桔紅色的區帶，根據Maker判斷擴增產物的長度。
三、 儀器 與試劑
（一）主要 儀器 ：PCR儀 潛水式電泳儀 微量移液器 臺式高速離心機
（二） 試劑 ：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理鹽水 雙蒸水
PCR反應液 液體石蠟 載樣緩沖液 電泳緩沖液
四、方法
（一）模板的制備
裂解細胞膜 1：用刻度 離心管 取全血0.5ml，加裂解液至3ml，顛倒混勻，振蕩60～80次。3,000rpm離心10分鐘。
去血紅素 2：棄上清，加生理鹽水至3ml，振蕩直至沉淀成線狀，3,000rpm離心10分鐘。
3：重復步驟2一次
破壞細胞核膜 4：棄上清， 離心管 倒置在濾紙上控干，加ddH ₂ O 50μl,用槍頭攪動沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白質 5：全部轉移至1.5ml 離心 管，沸水鍋中煮沸10分鐘，12,000rpm離心5分鐘，上清液即含有模板DNA。