PCR(Polymerase Chain Reaction )是一種在體外特異的擴增基因的技術。由Kary.Mullis發明，該技術大大推動了分子生物學的發展，被認為是分子生物學發展的里程碑。Kary.Mullis分享了1993年諾貝爾化學獎。
復習細胞內DNA復制條件和過程。
一、目的
1：學習PCR技術的基本原理
2：掌握從全血中制備DNA的方法‘
3：掌握應用PCR擴增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因結構
二、原理
1：PCR擴增的原理
聚合酶鏈反應—PCR是一種體外基因擴增技術，是在引物和四種脫氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反復作用，使微量的特定片段得以大量擴增的反應過程。
PCR所需的條件：模板
引物：決定擴增產物的特異性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg2+
PCR反應過程
每三步為一個循環，每循環一次，使模板DNA拷貝數增加1倍，理論上講，30個循環后，擴增產物為230拷貝
本實驗應用PCR技術擴增Hbβ基因上400bp片段
引物序列為 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR 產物的鑒定
含溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳
DNA在pH8.0電泳緩沖液環境下帶負電荷，向陽極移動。DNA分子量大小及形狀不同，電泳速度不同。在分子形狀相同的條件下，分子量（bp數）越大，電泳速度越慢；分子量（bp數）越小，電泳速度越快；分子量（bp數）相同，電泳速度相同。所以PCR擴增產物可以根據分子量（bp數）的大小進行分離。bp數相同的DNA集中在同一位置上，與EB結合成復合物，在紫外燈激發下，發出桔紅色的熒光，而形成桔紅色的區帶，根據Maker判斷擴增產物的長度。
三、儀器與試劑
（一）主要儀器：PCR儀 潛水式電泳儀 微量移液器 臺式高速離心機
（二） 試劑：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理鹽水 雙蒸水
PCR反應液 液體石蠟 載樣緩沖液 電泳緩沖液
四、方法
（一）模板的制備
裂解細胞膜 1：用刻度離心管取全血 0.5ml，加裂解液至3ml，顛倒混勻，振蕩60～80次。3,000rpm離心10分鐘。
去血紅素 2：棄上清，加生理鹽水至 3ml，振蕩直至沉淀成線狀，3,000rpm離心10分鐘。
3：重復步驟2一次
破壞細胞核膜 4：棄上清，離心管倒置在濾紙上控干，加ddH2O 50μl,用槍頭攪動沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白質 5：全部轉移至1.5ml 離心 管，沸水鍋中煮沸10分鐘，12,000rpm離心5分鐘，上清液即含有模板DNA。
(二）PCR擴增
反應體系：總體積：25 μl
模板液 5.0μl
緩沖液（含 Mg2+） 2.0μl
dNTPs（2.5mM） 1.6μl
引物(10μm) 各0.8μl
Taq DNA聚合酶 (2.5U/ml) 0.8μl
ddH2O 14.0μl
循環參數：預變性94℃ 2分鐘
變性94℃ 30秒
退火55℃ 30秒
延伸 72℃ 45秒
最后延伸72℃ 10分鐘 共35個循環。
（三）擴增產物的鑒定：
1：制膠 將凝膠托架兩端封閉并水平放置在工作臺上，放上梳子，用1 ×TBE緩沖溶液配制2﹪瓊脂糖凝膠液,加熱溶解.注到托架上,待凝固后撤去兩端封閉插片.
2: 加樣 將托架放入電泳槽中,加入1×TBE緩沖溶液使之沒過膠面2㎜，拔出梳子,向PCR產物中加入載樣緩沖液,混合.將15μl混合物加入凝膠樣品孔中.載樣緩沖液中有蔗糖和溴酚蘭，可以增加樣品比重,同時有顏色指示劑的作用。
3:電泳 加樣端接負極,蓋上電泳槽,接通電源,以100V電壓電泳25分鐘.
4:觀察結果 在紫外燈下觀察電泳結果.與maker400bp相對應的區帶為Hbβ基因400bp片段.
五、注意事項
1：操作的整個過程中避免污染,因為PCR可以將微量的DNA進行擴增而造成假陽性
2：血紅素是酶的抑制劑,必須去除干凈，但在去除過程中注意勿丟失DNA。
3：加ddH2O破壞細胞核膜是關系到本實驗結果好壞關鍵的一步,一定使核膜破壞充分,充分使DNA釋放