差示反轉錄PCR實驗——熒光標記法

人單核細胞系U937

胎牛血清TRIzol試劑Fluoro DD試劑盒Supersript Ⅱ逆轉錄酶Ampli Taq DNA聚合酶

手術刀片PCR儀凝膠成像儀離心管移液槍水浴鍋

一、材料

1.  標本

人單核細胞系U937，細胞密度2×10⁸/L，分對照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T 2），N用1640培養基及10%胎牛血清培養，T1用IFN-γ104U/L LPS 1 μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0 μg/L分別刺激7 h。

二、 總RNA的制備

1.  按試劑盒提供的方法分別提取三種細胞的總 RNA，以 RNase-free DNase I（終濃度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA經甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計檢測其純度。

三、 mRNA差異顯示

1.   逆轉錄反應

選擇錨定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列為5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T]，以總RNA為模板進行逆轉錄反應，每管反應體系如下：總RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，總反應體系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

2.   熒光標記差異顯示PCR 

選取與逆轉錄引物序列相同的帶熒光物 質標記的錨定引物[TMR-T7(dT12)AP]，隨機引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆轉錄產物為模板，進行PCR反應。反應體系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，3.75 mmol/L MgCl₂，逆轉錄產物3.0 μl，50 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1），0.35 μmol/L 5'-隨機引物，0.35 μmol/L 3-錨定引物，Ampli Taq 0.5 Units，總反應體系10 μl。反應步驟如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4個循環； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環；72℃延伸7 min。

3.   分離差異顯示片段

配制5.6%變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.25 mm，大小61×33 cm。將PCR產物加4.0 μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3 000 V、100 W 、55℃電泳4.5 h。干膠后置于Genomyx SC掃描，用系統所帶的AcquireSC program軟件分 析處理掃描結果。

4.   回收差異條帶

用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手術刀片切割下所需條帶，置于30 μl去離子水中，37℃水浴30-60 min，備用。

5.   差異條帶的再擴增

以經上述處理的回收條帶為模板，T7啟動子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物，進行再擴增反應：模板2.0 μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，總反應體系20 μl。反應條件同差異顯示PCR。

一、實驗討論

基因表達是調節細胞生物學行為的核心。探討處于不同生理、病理狀態下的有機體之間 的未知表達基因的差異，是研究生命本質的有效途徑。1992年報道的真核細胞mRNA差異顯示技術，為檢測未知的表達基因提供了一種新的途徑。DD技術具有快速、敏感、 可同時檢測兩組或以上的組織或細胞、RNA用量少、可檢測某一表達基因的有無或其表達的強弱等優點，一經問世即受到許多領域的重視并得以廣泛應用。然而，該技術也存在著一些缺陷，主要表現為：cDNA產物的質量較低，在序列膠中往往呈不清晰狀態；所得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻譯（編碼）序列；所得差異片段的假陽性高，可高達85%等。

熒光標記差異顯示技術通過對引物設計、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標記物的改進，極大減少了上述不足。

差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實驗通過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個亞群，這極大減小了每一錨定引物 產生的第一條cDNA鏈的數量，不僅可降低隨機引物的用量，更可降低DD產物的復雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統方法中常見的“重疊帶”現象減少。DD專用的隨機引物的特點為A+T與G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C結尾，可增加DD擴增的效率。通過改變RT-PCR反應條件如底物濃度、延伸時間等，差異片段的長度可達1.0-1.5 kb， 因較長的cDNA片段容易通過Northern blot 進行分析鑒定辨別真假陽性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。

文獻認為差異顯示居高不下的假陽性率實際上因再擴增所致。通常， 再擴增的引物與DD引物相同，本試驗將再擴增引物設計為T7（22-mer）與M13-r（24-mer），此為在錨定引物的5' 端和隨機引物的3' 端分別增加的序列（本文方法中所列差異顯示引物序列的 劃線部分），這兩種來源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴增的機會。同時，T7啟動子序列可直接用于體外轉錄合成cRNA探針，為cDNA片段的直接測序和鑒定（RPA或Northern分析）提供了方便。

用常規的序列分析膠進行分辨時，較長的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本 操作改用5.6%的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250μm），通過提高電泳的電壓（3000 V）及溫度（55℃），可顯著提高分辨率。

同位素標記存在曝光時間長、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點，將熒光物 質標記于錨定引物的5’端，可產生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。

目前，DD技術己被廣泛應用于與疾病、衰老、生殖、生長發育、分化等生理 、病理過程相關的未知表達基因的研究，相信對揭示生物界基因表達調控的奧秘將起重要的作用。