| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
1.5% 瓊脂糖凝膠，加溴化乙錠 (見第 9 步）
蒸餾水
DNA 點樣染料
30% 甘油
70% 蒸餾水
0.003% 溴酚藍
0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)
溴化乙錠溶液（0.5ug/ml)
蒸餾水
重新擴增混合液（見第 7 步）
2. 核酸和寡核苷酸
任意引物（H-AP)(2 mmol/L)
cDNA(切割的條帶），來自方案 5
dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)
未標記的錨定引物（H-T11M)(2umol/L)
載體特異性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]
3. 酶和酶緩沖液
10XPCR 緩沖液
100 mmol/LTris-HCl,pH8.4
500 mmol/LKCl
15 mmol/LMgCl2
0.01% 明膠
TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 專用設備
電泳裝置
1.5 ml 離心管
Parafilm
熱循環儀
0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)
UV 透射儀
微波爐
5. 附加試劑
PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404),
包括準備好插入的 PCR-TRAP 克隆載體、T4DNA 連接酶（200u/ul)、蒸餾水、10X 連接緩沖液（500
mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl2，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差異顯示系統（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)
6. 細胞
GH-competent 細胞
7. 特別項目
含有抗生素的瓊脂平板（參考克隆系統推薦的專用抗生素與方案）
二、方法
1. 將方案 5 中切下的條帶，放到 1.5 ml 離心管中，加入 1ml 蒸餾水。
2. 浸泡 30 min，時常渦旋混勻。
3. 除去蒸餾水（不要丟掉條帶），再加入 50ul 新鮮的蒸餾水。
4. 將離心管蓋緊（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，將 cDNA 從凝膠中洗提出來。
5. 離心 lmin，濃縮并收集凝膠。
6. 將上清液轉移到一個新的 1.5 ml 離心管中，棄去裝有凝膠的管子。
7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列組分完成 cDNA 的重新擴增。
蒸餾水 22.6ul
10XPCR 緩沖液 4.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.0ul
H-AP 引物（2umol/L) 4.0ul
H-T11M(2umol/L) 4.0ul
cDNA 模板 4.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.4ul
8. 將重新擴增的反應液放在熱循環儀上，以最初 PCR 條件（見方案 4 第 1 步）進行反應。
9. 配制含有溴化乙錠的 1.5% 瓊脂糖凝膠。
a. 在玻璃燒瓶中，稱 1.5 mg 超純的電泳級瓊脂糖。
b. 加 1XTAE 至 100 ml。
c. 將瓊脂糖放到微波爐中熔化。
d. 冷卻后，加入 3ul1:1 的溴化乙錠溶液。
e. 混勻后，倒入凝膠裝置中。
f. 放好梳子，等膠凝固。
g. 電泳緩沖液為 1XTAE 溶液（凝膠裝置不同，用量也不同）。
10. 在 0.5 ml 的離心管中，加入 30ul 的再擴增反應液和 5ul DNA 點樣染料。將混合液全部加到 1.5% 瓊脂糖凝膠上。
11. 在 70V 電壓下電泳大約 45 min。
12. 用 UV 透射儀進行觀察，以確認 cDNA 再擴增反應產物。
13. 按照廠商給的方案，將差異表達的 cDNA 克隆到推薦的 PCR-TRAP 克隆載體或其他合適的載體中。
14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的載體特異性引物進行測序。如果使用其他的克隆載體，請參考廠商的測序說明書。
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