工業生物技術VS生物制藥：基于細胞工廠下的多元發展

工業生物技術和生物制藥生產利用生物學使細胞系統成為工廠，生產對人類有價值的分子。這些生物技術過程利用各種宿主生物，并涉及生物燃料、聚合物構件、抗生素和全細胞療法等應用。除了化學生產外，工業生物技術還可以實現環境和可持續發展目標。同樣，生物制藥領域已經并將繼續生產救命藥物。盡管這些應用多種多樣，但這些領域依賴于共同的生物學主題，并且需要類似的遺傳和代謝工程方法。通過合成生物學、靶向基因工程、DNA 測序、馴化和高通量篩選方面的進步，工業生物技術和生物制藥生產利用相同的框架實現高效的生化生產，可在當前和未來的合作中利用該框架實現快速創新。

簡介

重組 DNA 技術的強大功能使社會能夠將生物技術應用于各種領域，而人類仍處于實現這些益處的早期階段。即使在早期階段，不同類型的細胞也已表現出解決特定類型問題的能力。例如，微生物的環境、基因、代謝和生長方式各異，在解決受益于多樣化生物化學和強勁生長能力的應用方面特別有用。工程哺乳動物細胞具有非常復雜的能力，可以合成復雜的產品——從單克隆抗體 (mAb) 和疫苗到基因治療載體。此外，哺乳動物細胞可以產生復雜且類似于人類的翻譯后修飾，例如糖基化，這對于適當的藥理活性至關重要。除了充當生物工廠外，用于生物制藥應用的細胞已經超越了工廠的作用，本身也是藥物產品，例如 CAR-T 免疫療法。

工業生物技術利用生物技術生產大宗商品和特種化學品，或回收廢物和塑料，其利用多種微生物作為細胞工廠。這些應用通常（但并非總是）以高產量、低利潤產品為特征。工業生物技術最常使用細菌、酵母或真菌，利用中心碳代謝途徑來實現和增強所需化合物的生產，應用領域包括生物燃料、大宗化學品和聚合物前體。除了化學生產外，這些生物的使用還擴展了可以利用的碳原料，包括木質纖維素生物質和廢油。這些微生物可以幫助實現溫室氣體排放和廢物管理的目標，同時可能進行生物化學生產。從自然界中分離或在研究實驗室內設計的微生物可以耐受高溫、高壓、高鹽和有毒化學物質等環境，有時甚至在這些環境中繁衍生息，而這些環境對商業生產是有利的。

與工業生物技術一樣，生物制藥生產依靠細胞系統來生產藥物。然而，這些過程通常以低產量、高利潤產品為特征。由此產生的化合物范圍從小蛋白質和抗體到疫苗，甚至是作為遞送工具或療法的整個細胞。對于這些生物藥物，需要進行廣泛的臨床研究和監管批準，以保護患者的治療效果。所需產品的復雜性決定了宿主的選擇，細菌和酵母中產生的產品更簡單，而哺乳動物細胞系中產生的蛋白質更復雜，尤其是需要糖基化的蛋白質。適當的糖基化是藥物產品的關鍵屬性，會影響藥物靶向、體內活性和半衰期。由于獲批的單克隆抗體藥物數量不斷增長，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞是最常見的宿主，骨髓瘤 NS0 和 Sp2、BHK- 21和人胚腎 (HEK293) 細胞也用于特定產品類別。

除單克隆抗體外，疫苗和細胞/基因療法分別是最成熟和最新的生物制藥產品。疫苗生產根據分類和復雜程度使用各種宿主細胞，而細胞和基因療法通常僅用于特定細胞類型。與細菌和酵母相比，哺乳動物細胞的生長速度較慢，因此使用哺乳動物細胞會延長實驗設計時間，這可能會給合成生物學工具的應用帶來挑戰。盡管如此，生物制藥生產領域已能夠生產多種藥品。

在工業生物技術和生物制藥生產中，后期生產工藝是從生物反應器環境的細胞和上清液的中分離所需產品的關鍵步驟。這些過程可能因所生產生物化學品的特性和應用而有很大差異，這需要額外考慮工藝放大和最終的經濟可行性。用于下游工藝的單元操作可以包括過濾、層析、病毒滅活、液-液萃取和/或蒸餾，需要幾個純化步驟才能達到所需的純度。無論是在工業生物技術還是生物制藥生產中，下游純化都是一個完全獨立但相關的領域。

工業生物技術和生物制藥生產代表了生物技術中的應用，它們依賴于生物學基礎并使用相同的技術和方法（圖 1）。每個領域在生產有用的生物分子方面都有獨特的特點，如表 1所示。具體而言，工具和篩選方法的相似性將工業生物技術和生物制藥生產結合在一起。

圖 1. 合成生物學工具箱和菌株/克隆開發的進步使細胞系統可用作工業生物技術和生物制藥生產中跨產品的生物工廠。這兩個領域之間的進一步合作和創新可以利用相似性來實現生化生產的宏偉目標。

表 1. 工業生物技術和生物制藥生產在生產有用生物分子方面的特點

合成生物學工具箱使基因工程更接近理想的“即插即用”系統，其中各個部件可以互換使用，并在宿主生物體中發揮可預測的功能。此外，包括 CRISPR 和測序技術在內的基因工程技術在過去 20 年中得到了顯著改進，從而實現了更高效的細胞操作。借助這些新的基因改造技術，需要快速篩選來完成設計、構建、測試、學習周期，以提高生物分子的生產。除了分析開發之外，機器人和自動化還使這種快速篩選能夠更快地識別出產量最高的菌株或克隆。

在信息較少的情況下，尤其是在非傳統宿主中，人們利用馴化來提高化學產量或耐受惡劣環境。這些技術共同推動了兩個行業的成功，并成為創新的共同基礎。此外，這些行業依賴于相同的經濟可行性和高效代謝基礎，這增加了使用生物生產系統的復雜性。平衡培養污染風險與高效穩定生產，用于化學或藥物的生物分子需要對生物系統有復雜的理解和控制。

為了成功開發未來的藥物和生物化學品，持續和額外的合作努力可以促進創新，以應對 21 世紀與食品、燃料和人類健康有關的全球挑戰。工業生物技術能夠將非食用碳用于生物燃料工藝，并可以創造許多替代對不可再生化石燃料的依賴所需的商品化學品。雖然生物制藥生產的應用范圍更加廣泛，但這些應用仍然涵蓋各種醫療治療，例如救命的胰島素蛋白、高特異性單克隆抗體，甚至可以作為癌癥和遺傳疾病的治療方法。本文將簡要總結了工業生物技術和生物制藥生產中與細胞系/菌株開發和工程相關的幾個領域，為這些領域之間持續和額外的合作與創新提供動力。

生物制藥生產與工業生物技術的相似之處

工業生物技術和生物制藥生產嚴重依賴細胞系統作為“生物工廠”，生產具有多種用途的有用化合物。無論選擇哪種生物和分子，工業相關規模的生產都依賴于利用 DNA 或 RNA 水平的生物操作來進行基因改造。這些系統還依賴于控制碳從原料到所需產品的相同代謝途徑。

合成生物學的進展

合成生物學工具的發展使得各種生物體可用于生物生產。從基因表達的構建模塊（零件工具箱）到基因編輯和 DNA 測序，合成生物學的進步促進了生物制藥生產和工業生物技術應用的產品開發。

合成生物學工具包

重組化學和生物制品生產的核心是生物體的基因工程，以實現或增強生產。這種工程依賴于合成生物學部件（啟動子、終止子、增強子等）工具箱作為構建模塊，以實現高效的基因和蛋白質表達，并最終實現正確的蛋白質折疊和定位。這些工具箱組件還希望能夠獨立發揮作用，以便直接“現成”地混合搭配部件。由于這些構建模塊在生物技術應用中發揮著關鍵作用，因此已經進行了大量研究來識別天然序列以及通過將較小的功能單元組合在一起來創建合成版本。就啟動子而言，轉錄因子結合位點和有效的核糖體結合位點已成為從大腸桿菌和酵母到 CHO 細胞和人類細胞系的所有進化尺度上啟動子設計的基礎。作為繼目標基因之后的第二重要核心元素，終止子通常通過序列修飾來實現表達的微調，以實現最佳表達。

啟動子可能是合成生物學工具箱中研究最深入的組成部分。這些系統的工程設計會導致基因表達發生巨大變化。誘導和調節基因表達的能力對于在生長和蛋白質或化學品生產之間找到平衡至關重要。因此，在工業生物技術和生物制藥生產應用中，需要在各種宿主生物中發現和開發啟動子（表2）。啟動子的長度和結構復雜性隨著進化復雜性的增加而增加，細菌、酵母和哺乳動物生產宿主有幾個關鍵特征（表2 ）。天然啟動子序列的挖掘已應用于微生物和哺乳動物培養物，以利用先天轉錄因子結合基序。這些因子的保守存在使管線方法能夠應用于任何感興趣的生物體，以用于任何應用。

表 2. 合成生物學工具箱中可用于跨生產宿主基因工程的選定啟動子的特征

具體而言，在哺乳動物細胞中，轉錄因子核因子 κB (NF- kappaB) 存在于生物制藥應用中常用的 CMV 啟動子中。雖然酵母中不存在這種因子，但逆行反應基因可以完成類似的功能。除了保守的結合基序外，所有生產宿主都需要并希望具有誘導性和多表達盒等特征，以進行生化生產。在許多情況下，核心啟動子序列可以與其它啟動子序列的上游激活序列多重化以生成新序列。持續研究和開發啟動子序列（尤其是哺乳動物細胞的啟動子序列）對于擴展合成生物學工具箱、以使用更短的序列實現更嚴格的表達控制并最終提高產量至關重要。

從各種基序構建的類似方法已應用于終止子的開發。盡管這些區域研究較少，但它們對于微調 mRNA 半衰期、以實現最佳基因表達至關重要，并且已在所有生產宿主中進行改造。在部署相同的序列結構時，釀酒酵母和人類細胞系中同時開發了一系列終止子，表現出廣泛的活性。這些例子突出了合成生物學部分的 DNA 分子基礎，這些部分在工業生物技術和生物制藥生產的應用中是保守的。

雖然啟動子和終止子被認為是控制基因表達的關鍵，但它們僅代表合成生物學工具箱的兩個部分。為簡潔起見，本文不討論阻遏物、絕緣子、激活子和增強子，這些內容已在其它地方進行了廣泛綜述。隨著各種合成生物學工具的不斷發展，開源項目一直在尋求提供數據存儲、工具組織和常規分析參考軟件的標準化。這些努力包括合成生物學開放語言 (SBOL)、SynBioHub、SynBiopython，它們為實驗室提供了工具和信息，以加快進展，因為可訪問性使研究人員能夠在他人工作的基礎上進行研究。繼續共享合成生物學工具箱知識將有利于工業生物技術和生物制藥生產應用。

基因編輯，包括 CRISPR

用于工業生物技術或生物制藥生產應用的基因工程依賴于將所需的基因有效運送到基因組內的已知位置。位點特異性工具（包括鋅指核酸酶 (ZFN)、轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR）的發現使這種精確的基因工程成為可能。通過利用 DNA 相互作用，這些方法可廣泛應用于所有生命領域，并應用于工業生物技術和生物制藥生產。CRISPR 的具體應用涵蓋大量文獻，大腸桿菌、釀酒酵母和 CHO 細胞的基因編輯在其它地方得到了廣泛的評論。

除了直接基因編輯外，CRISPR/Cas 系統還被以多種方式修改和重新利用，成為一把“分子瑞士軍刀”。Cas功能的部分或全部失活已被用于微調行為，以增強基因編輯，以更嚴格地控制基因表達或抑制以及用于所有細胞主力和產品應用中的各種 RNAi 策略。此外，基于 CRISPR 的產生 DNA 切口的方法已被用于增強位點特異性整合和突變生成，以用于篩選目的。基因編輯工具是所有生物技術應用的核心，是工業生物技術和生物制藥生產領域之間的共同點。

DNA測序

DNA 測序技術與基因編輯創新密切相關，過去 20 年來 DNA 測序技術的進步推動了所有生命的生化生產。常規生產宿主基因組，如大腸桿菌（460 萬個堿基對）和釀酒酵母（1200 萬個堿基對），分別于 1996 年和 1997 年首次測序并發表，而人類基因組計劃于 2000 年發布了第一個人類基因組。完整的序列和組裝需要另外 20 年才能完成，部分原因是其它技術進步使得更長、高保真度的測序讀數成為可能。

使用平行反應的測序技術的發展實現了高保真度和更長的讀取長度，同時降低了成本。傳統的 Sanger 測序適用于短讀取就足夠的項目，通常小于 1kb。通過部署邊合成邊測序的方法，可以使用直接熒光或合成后檢測（通過釋放的磷酸基團或 pH 變化）來量化新添加的核苷酸，如 Illumina 和 Ion Torrent 技術中使用的一樣。對于超過 500 個堿基對的讀取長度，單分子測序技術使用納米級表面在 PacBio 儀器中進行 DNA 合成，或在 Oxford Nanopore 測序的情況下進行直接檢測。

這些技術進步和從Sanger測序到下一代測序方法的各種方法值得進行獨立總結。具體而言，在利用馴化的應用中，例如適應實驗室進化，DNA 測序提供了關鍵的見解，并可以為所需表型提供致病突變，這可以應用于工業生物技術和生物制藥生產。

同樣，對于非常規生物、微生物群落甚至無法在體內培養的生物，測序可以進行基因組挖掘，從而提供關鍵見解和潛在的新型酶。具體而言，在生物制藥領域，全基因組組裝對于主力細胞 CHO 細胞來說一直是一個挑戰。在過去 5 年內，小分子實時測序與大量支架相結合，生成了最新的中國倉鼠基因組組裝，其序列覆蓋率為 97%，可直接用于 CHO 細胞應用。DNA 測序技術的持續發展將加快數據收集速度、縮短分析時間，并實現更穩健的注釋和組裝，從而能夠快速研究用于生化生產的細胞系統。

菌株/克隆開發

代謝工程設計、構建、測試周期的一個關鍵方面是評估菌株或克隆以確定最佳生產者。這個過程可以稱為微生物宿主的菌株開發或哺乳動物宿主的克隆開發，并利用馴化和高通量篩選。這些工具可以找到“大海撈針”細胞，這些細胞可能具有適當的基因修飾、所需的酶突變，甚至對工藝雜質具有更高的耐受性。從利用轉基因隨機整合的傳統方法到更有針對性的點突變，都需要進行篩選、以分離所需的表型和相應的細胞。

在工業生物技術和生物制藥生產中，單細胞/菌株克隆對于持續生長和生化重現性至關重要。具體而言，在生物制藥生產中，需要進行克隆篩選以分離具有良好產品質量屬性（例如糖基化或電荷變體）的均質群體。除了發現所需的罕見事件外，還需要開發菌株/克隆以確保最佳生產宿主。雖然傳統的菌株/細胞系開發是在體內進行的，但最近的研究正在利用無細胞或混合方法進行生物分子生產。這些系統能夠使用細胞裂解物構建復雜的途徑網絡，與廣泛的細胞工程相比，可以通過混合快速多路復用。無論是在體內還是體外進行，細胞系/菌株的開發對于創建生物分子生產平臺都至關重要。

馴化

馴化是一種廣泛使用的技術，它利用自然或誘導突變來創造多樣化的細胞群體并實現工業生物技術和生物制藥生產中所需的行為。馴化通常在直接機制未知時使用，它可以根據外部所需的表型選擇細胞。馴化或適應性實驗室進化 (ALE) 經常用于工業生物技術應用，它利用基于生長的選擇來改善生長或對抑制化合物的耐受性。馴化通常在較短的時間范圍內進行，較長的研究（30 個以上的生長周期）被稱為 ALE。抑制化合物的范圍可以從代謝溢流產物到木質纖維素生物質的副產品和用于回收的廢棄碳源。ALE 的實施提高了釀酒酵母對乙醇的耐受性，從而提高了產量，并提高了甲醇依賴性甲基營養菌谷氨酸棒狀桿菌對甲醇的耐受性/轉化率。

通過類似的方法，大腸桿菌、馬克斯克魯維酵母、解脂耶氏酵母和運動發酵單胞菌等多種生物宿主都實現了對苯酚和糠醛等有毒化合物的耐受性。在已知其它機制的情況下，可以應用定向進化，引入有針對性的突變，而不是依賴于全基因組的隨機修飾。定向進化通常用于酶或其它小分子篩選，以改進或多樣化功能。無論采用何種方法，工業生物技術已經并將繼續利用基于進化的方法的優勢來實現生產目標。

與此同時，生物制藥生產業長期以來一直應用馴化來識別在懸浮培養中生長快速的細胞系和適當的選擇標記。具體而言，在 CHO 細胞中，采用隨機和化學誘變的馴化方案已使甲氨蝶呤和谷氨酰胺合酶選擇系統能夠富集具有更高目標蛋白表達的細胞系。在這些情況下，馴化創建的細胞系可使用選擇標記和上面討論的合成生物學工具進一步操作。為了實現高水平生產，各種細胞系類型（包括但不限于 CHO、HEK293 和 Vero 細胞）已從貼壁生長條件適應為懸浮生長條件，以支持高細胞密度。在生物制藥生產和工業生物技術中，已部署馴化，以實現多種細胞表型。

高通量篩選

基因編輯和/或改造后，需要進行篩選以確定最佳生產克隆或菌株。隨著基因編輯和工具的進步，篩選工作的群體規模急劇增加，同時需要縮短從發現到上市的時間，這需要部署高通量方法。高通量篩選包括細胞培養的小型化和快速分析，以測量所有適當的參數。在生物制藥生產和工業生物技術中，高產物滴度、產量和生產率是優化的關鍵參數。產品質量屬性（例如翻譯后修飾）也是生物制藥篩選的重要參數，而工業生物技術應用可能側重于使用非傳統底物作為另一種篩選指標的穩健增長。考慮到細胞培養的微型化，新技術可以利用微流控裝置和獨特的幾何形狀監測從 μL 到 250 mL 規模的細胞，以創建精確的縮小模型。類似地，過程分析技術的并行化和發展使得篩選更大群體成為可能，從而提供了對做出明智決策至關重要的額外數據深度。對于快速分析，微量滴定板歷來與熒光或光譜測量一起使用。較新的數據分析已經實現了生物傳感器檢測、基于電化學的傳感器和質譜方法，具體取決于分析物的大小和特性。

機器人技術和先進的自動化技術（包括液體處理系統）徹底改變了高通量篩選的能力和速度。使用簡單的模塊化組件，這些設備可以很容易地部署在工業生物技術應用中，以測量溫度、細胞密度和熒光等在線參數。Chi.Bio系統以12-25 ml的規模運行，與 eVOLVER 技術配對，可以通過一臺計算機監控和控制多個微型反應器。雖然這項技術已經用于連續進化應用，但它也可以用于對菌株開發中關鍵參數進行高通量分析。

此外，微流控技術的部署使得各種篩選方法成為可能，包括活細胞熒光成像。先進的微流控裝置可以監測單個細胞的生長，并分離出所需的克隆，以用于工業生物技術和生物制藥應用。這些裝置使用精心控制的流體運動來篩選和選擇大腸桿菌（ SIFT 系統）和哺乳動物細胞系（Berkeley Lights Beacon 系統）。高通量篩選的這些發展提高了使用各種生產宿主的工業和生物制藥生產應用中的生物技術生產。將關鍵產品屬性的檢測實時或近實時地實現，可以更快速、更明智地做出篩選過程決策，從保留多少克隆到確定最佳條件。馴化和高通量篩選是關鍵的上游開發技術，被廣泛用于工業生物技術和生物制藥生產行業，以確定最有效的細胞工廠。

總結

工業生物技術和生物制藥生產都具有強大的生物學基礎，它們依賴類似的概念、方法和技術。此外，合成生物學、測序技術和高通量篩選的進步在過去 20 年中推動了快速發展，產生了各種新產品。基因工程項目產生的生物化學物質甚至細胞本身具有與食品、燃料和人類健康相關的多種應用。

為了繼續推進生物技術的發展，學術界和行業伙伴之間的跨學科合作變得越來越普遍。這些項目或團體擴大了現有的專業知識，使參與者能夠利用他們原本無法獲得的技能和設備。雖然這些團體代表了學術和工業研究人員在聯系方面取得的巨大進步，但很少有人將工業生物技術和生物制藥生產的進展聯系在一起。跨項目共享細胞系/菌株篩選的技術和最佳實踐將使生物制藥生產和工業生物技術應用的流程更加高效。一般的工藝開發步驟得以保留，并可以幾乎相同的方式實現自動化。同樣，可以共享合成生物學工具的發現和構建，以實現更高效的蛋白質表達，無論是作為直接產品還是生化生產的關鍵催化劑。通過進一步合作，未來的創新可以將工業生物技術和生物制藥生產聯系起來，以更快地將細胞設計成高效的生物工廠。