1. 簡 介
膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，在我國每年有約15萬的膀胱癌新發病例，而且發病率呈逐年增高之勢。由于全部尿路從腎盞、腎盂、輸尿管、膀胱及前列腺和尿道均為移行上皮所覆蓋，所以90
%以上是移行細胞癌(Transitional Cell Carcinoma,
TCC)，少數為鱗癌和腺癌。移行細胞癌患者中近30％初診時已有肌層浸潤，其余70％為淺表性膀胱癌；雖采用經尿道切除和膀胱腔內輔助治療可獲得良好效果，但復發率高達50％～70％，而且10％～15％的復發腫瘤侵及肌層，有時復發會在術后數年發生。因此，早期診斷和長期復查監測非常必要[1]。
膀胱癌診斷和篩查的主要手段是膀胱鏡下活檢和尿細胞學檢查。雖然膀胱鏡是診斷復發性尿路上皮癌的金標準，但是具有侵入性，且對于微小病變和原位癌不易辨認。尿脫落細胞病理學檢查雖然無創傷，然而陽性率僅為8
%～46 %，尤其在檢測低級別腫瘤時敏感度更低,
而且結果判斷具有主觀性，容易產生偏差。另外，感染、結石等亦可影響細胞的形態而造成假陽性[2]。鑒于尿細胞學和膀胱鏡檢查存在的種種缺陷，尿液診斷膀胱癌一直是研究熱點并取得了一定的成果。
2.獲FDA批準的膀胱癌尿液檢測方法
獲FDA(美國食品和藥品管理局)批準的膀胱癌尿液檢測方法迄今只有尿核基質蛋白22、膀胱腫瘤抗原（BTA）、免疫細胞檢查法(
ImmunoCyt)
、纖維素和纖維蛋白原降解產物及熒光原位雜交（FISH）5項。上述方法除FISH以外均已應用多年，但和FISH一樣都存在敏感度和特異度不足的問題，只能作為細胞學和膀胱鏡檢查的補充，無法替代[3]。
2.1 核基質蛋白22（NMP22）
NMP22是組成細胞核內部結構的支架,而且同DNA復制、RNA合成、激素聯接、基因表達調控密切相關。作為一種核有絲分裂器蛋白，NMP22在分裂間期含量很少。膀胱癌時大量腫瘤細胞凋亡并將NMP22釋放入尿，使其水平可增高25
倍。以10 kU/ mL為臨界時，它對膀胱癌診斷的敏感度為69.7 %，特異度為78.5 %，對浸潤性膀胱癌診斷的敏感度為100
%[4]。但膀胱癌患者尿中NMP22
水平增高，與腫瘤的分級、分期不相關。盡管NMP22的敏感度較細胞學檢查高很多，但研究證實在有膀胱炎癥和其他腫瘤如腎細胞癌存在時，NMP22水平也升高，因此對于已經確診為膀胱癌的病人來說，NMP22顯得更精確一些。
2.2 膀胱腫瘤抗原(BTA)
BTA是膀胱腫瘤在浸潤和生長過程中釋放的蛋白水解酶降解基底膜的各種成分形成的膠原片段、糖蛋白、蛋白多糖等釋放進入膀胱腔內形成的復合物。單抗免疫分析法BTA
- stat檢測敏感度67 %～87 % ,對于膀胱移行細胞癌（BTCC）術后隨訪腫瘤的特異度49 %～70 %[4] ,可用于BTCC
的篩查。由于敏感度特異度偏低，近年已逐漸被其他方法所取代。
2.3 免疫細胞學檢測
免疫細胞學檢測是細胞學和免疫熒光的結合，即用單克隆熒光抗體檢測膀胱癌脫落細胞的特異性分子標志物。總體敏感度和特異度一般，約為86％和79.4%[2]，而且需要專門的實驗室和培訓技術人員，應用面不廣。
2.4 纖維素/纖維蛋白原降解產物
纖維素/纖維蛋白原降解產物是由纖溶酶作用于纖維素和纖維蛋白原后所產生的蛋白質片段。膀胱腫瘤細胞產生的血管內皮生長因子能夠增加微小血管的通透性，從而引起血漿蛋白漏出。凝血因子快速將纖維蛋白原轉化為纖維素，然后再被纖溶酶進一步降解成纖維素降解產物（FDP）。目前常用的Colorimetric
FDP 實驗簡單快速診斷膀胱癌總的敏感度82.1 %，Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級TCC 的敏感度分別為63.2 %、88.2 %和95
%。對于健康者,其他尿路疾患和膀胱鏡檢未見異常的TCC 復查者,其特異度別為96 %、86 %和80
%[5]。但在前列腺癌、膀胱炎癥，尤其是腎盂腎炎的病人，FDP實驗很容易出現假陽性。
2.5 熒光原位雜交
熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization ,FISH)是用熒光標記的核酸探針和中期或間期細胞DNA雜交，檢測DNA 序列及其變化的方法。具有快速、無創性、敏感度高和特異度強等優點。
膀胱癌細胞易發生非隨機的染色體改變，包括結構畸變和染色體數目異常。常見結構畸變染色體有3、9、1、5、11
、21 、17 ，染色體數目異常有3、9、7、10 、11 、Y、1、8、17 、15 [6]。臨床研究發現9
號染色體部分或全部丟失在膀胱腫瘤中最常見，超過50 %膀胱癌患者有此染色體改變，被認為是腫瘤發生的早期事件和關鍵步驟；其次是17
號染色體畸變，可能與腫瘤浸潤行為有關，因為有17號染色體非整倍體的腫瘤具有更高復發率和浸潤性；7號染色體畸形也常見于膀胱癌，以三倍體多見，也可有四倍體(約占38
%)，它可以單獨出現在膀胱癌，但更多是伴隨其他染色體改變一起發生；3 號染色體異常在BTCC約占30 %
，而且常與其他染色體的異常并存，可以有染色體移位和數量變化，與復發有關。其他染色體異常有男性膀胱癌約半數患者被發現Y染色體丟失，11
號染色體單體等。
FISH的一個重要特征就是能比膀胱鏡更早發現膀胱癌，膀胱鏡陰性FISH陽性的術后隨訪病例在3～12個月中有41％～68％被確診為膀胱癌，而雙陰性的情況下只有19％在3～19個月后確診為膀胱癌。Vysis
公司研發的Urovysion
試劑盒通過熒光原位雜交分析尿脫落細胞染色體3、7、17號非整倍體和染色體9p21丟失以診斷膀胱癌，據稱能達到85％的敏感度和97％的特異度[7]。
FISH存在的問題有Ta、Tis期腫瘤相對敏感度較低。尿液量不夠，低腫瘤負荷，腫瘤細胞未脫落也可能對敏感度有影響。而且高昂的價格和繁瑣的操作過程也影響了它的應用和推廣。
由于這些診斷方法依然無法滿足臨床需要，近年來，經過廣大科研人員的努力，發現了很多具有診斷潛力的膀胱癌分子標志物。
3. 研究中的分子診斷方法
3.1 染色體檢測
3.1.1
短串聯重復序列（STR）檢測
在腫瘤發生機制上，除了癌基因激活以外，抑癌基因失活也起了極大的作用。通常抑癌基因失活多通過雜合性缺失途徑（LOH），包括兩個獨立的過程，一個等位基因所在染色體片段缺失和另一個等位基因發生突變或甲基化，是膀胱癌時p16抑癌基因失活的最常見機制。微衛星不穩定性（MSI）是研究LOH的最常用方法。微衛星是廣泛存在于原核及真核細胞基因組中的簡單串聯重復序列,其數目巨大且分布廣泛。人基因組中平均約50
kb 就有一個位點存在，是基因復制或細胞減數分裂過程中染色體不對等交換產生的寡核苷酸重復序列。大量研究顯示, 在TCC
中存在總體上染色體的不穩定性,
多條染色體多個區段發生LOH。研究證明只需做20個高信息含量位點就可以達到充足的信息量[8](敏感度95％以上）用以檢測各種類型膀胱癌，而且不受腫瘤病理分級和分期的影響。另有研究顯示微衛星改變存在人種差異或病因學差異，因而選擇地域、種族特異性微衛星位點組合,有可能顯著提高膀胱腫瘤診斷的敏感度和特異度。有研究表明,在膀胱炎性改變時尿沉渣微衛星分析有很高的假陰性,雖然微衛星在研究LOH方面是值得信賴的，但是由于大量的LOH模式尚未清晰，還需要花費大量的時間和精力去研究，再加上MSI分析需要異常細胞含量占到10％以上，以及尿沉渣細胞無法滿足的大量DNA，這些都限制了它的應用。Utting等[9]認為,
利用尿液離心后上清液中游離的DNA (無細胞沉淀物)作為檢測標本分析微衛星異常診斷膀胱癌優于尿液細胞沉淀物,
其原因可能是上清液中腫瘤DNA與正常細胞DNA 的比值高于尿沉淀物, 更利于檢測LOH。
3.1.2
單核苷酸多態性檢測
DNA的單核苷酸多態性（SNP）亦是研究LOH的方法之一。他們大量存在于人類染色體中，大約相隔100－300bp就有一個，因此檢測SNP比微衛星技術敏感度更高[10]。現有的檢查手段,包括尿液細胞學檢查和一些分子標志物檢查都受一些問題的困擾,例如難以區分腫瘤細胞和炎性細胞,對于高分化癌診斷的陽性率過低等,尿液脫落細胞SNP的檢測有可能克服這些缺點,成為膀胱癌早期診斷的理想指標[11]。但SNP檢測的不足也很明顯，使用基因芯片的方法成本比較高，另外尚無證據表明能幫助腫瘤的分級和分期。
3.1.3
甲基化檢測
CpG島是人類基因啟動子富含CpG雙核苷酸的區域,在正常狀態下是未甲基化的,其甲基化狀態與基因轉錄及表達活性有關,并因此影響基因的功能。隨著甲基化檢測技術的出現和不斷改進,發生啟動子過甲基化的基因數目在迅速增加。CpG島的過甲基化幾乎在每種類型的腫瘤中都有發生,并且涵蓋了DNA修復、細胞周期、細胞凋亡、細胞黏附、細胞代謝等各個方面[12]。
由于膀胱癌發生的機制具有多樣性，因此在不同膀胱癌中檢出的發生甲基化位點也不盡相同。至今仍無單個基因能達到足夠診斷的敏感度和特異度的例子。但很多研究人員使用不同的位點組合檢測膀胱癌病理標本已經達到了90％以上的敏感度和特異度[12]，受尿沉渣細胞量的限制，敏感度普遍稍低，雖然亦有100％的報道，但尚缺乏大樣本研究證實。
甲基化研究有助于腫瘤分級分期和預后判斷。Catto等[13]研究了12個基因啟動子的甲基化情況，檢出率為86％。其中RARb，DAPK，CDH－1，RASSF1A甲基化情況和腫瘤分期相關，DAPK，RASSF1A啟動子甲基化陽性的膀胱癌更容易惡化并且后者和高病死率密切相關。對于原位癌（pTa），DAPK或者hMLH1甲基化預示著更高的復發概率。pT1患者中RARb甲基化的腫瘤不易進展，病死率也低。CDH－1在pT2－4的患者中有一定的保護意義。Friedrich等[14]從抑癌基因、凋亡相關基因、黏附分子、血管生成等4大類21個基因中篩選出6個基因甲基化和膀胱癌復發相關。給甲基化研究又添加了一項優點。
甲基化檢測的手段多種多樣，現在常用的甲基化特異性PCR還具有如下優點：①高通量，高敏感，最低能檢出含量只有0.1%～0.01％的異常DNA，能早期檢出微小的腫瘤甚至是癌前病變。②不像突變檢測，無需對基因進行測序、排除變異情況等復雜的前期準備。③相比LOH檢測能省去血液匹配檢測等麻煩的過程[15]。但其缺點也很明顯，需要亞硫酸鹽處理過夜，步驟較多，費時較長，模板在處理之后變成小片段，影響擴增，泌尿系統其他腫瘤脫落細胞可能會混雜其中影響結果判斷。