[實驗原理]
RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA必須最大限度地抑制提取過程中內源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。本實驗以小麥為材料，采用異硫氰酸胍—苯酚—氯仿抽提法或CTAB法提取總RNA。異硫氰酸胍是高濃度變性劑，可溶解蛋白質，破壞細胞結構，使蛋白質與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、均一的總RNA。mRNA僅占總RNA的1%-5%，由于大多數真核mRNA
3’端具有多聚腺苷酸結構（polyA），因此可采用寡聚(d丁)纖維素親和層析柱分離出mRNA。
[儀器、材料與試劑]
(一) 儀器和材料
紫外線透射儀、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳系統、小麥黃化苗
(二) 試劑
4M異硫氰酸胍、2M NaAc（pH 4.8）、4M LiCl、3M NaAc（pH5.0），以上均用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）配制，然后高壓滅菌
5X甲醛凝膠電泳緩沖液：嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）0.1M、NaAc40 mM、EDTA 5 mM
高鹽緩沖液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；NaCI 0.5M ；pH7.4。
低鹽緩沖液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；NaCI 0.1M ；pH7.4。
洗脫緩沖液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；pH7.4。
CTAB抽提緩沖液配制：用0.1%DEPC溶液配制2%（W/V）CTAB、2%PVP，25mM EDTA、2M
NaCl（只配至60%的終體積），于37℃過濾后滅菌，再將DEPC水配制的1M Tris-Cl（pH8.0）稀釋至終濃度為100
mM，然后溶入亞精胺至終濃度為0.5g/L，4℃短期保存，-20℃長期保存。
[實驗步驟]
(一)提取小麥總RNA
1、實驗前10天左右播種小麥種子，生長約10cm黃化苗（避光）。
2、稱取1.2g小麥葉片，剪碎（冰浴），移入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，移入50ml離心管。
3、加入4M異硫氰酸胍4ml，苯酚3ml，2M NaAc（pH 4.8）0.3ml，氯仿0.6ml，混勻，冰浴放置30min（破壞細胞結構，失活RNA酶）。
4、4℃，8000r/min，離心13min。棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中，加入2倍體積無水乙醇，-20℃，1h。
5、4℃，8000r/min，離心13min。棄上清，在沉淀中加入1ml 4MLiCl，使溶解。移入1.5ml Eppendof管中，冰浴2h。
6、13000r/min，離心15min。棄上清，在沉淀中加入400uL水（經DEPC處理），再加入400uL氯仿混勻（去蛋白）。
7、13000r/min，離心6min。取上清，并加入1/10體積3MNaAc（pH5.0），2倍體積無水乙醇，-20℃放置30min。
8、13000r/min，離心13min。將沉淀RNA用70%乙醇洗滌2次（70%乙醇用DEPC配制），室溫下干燥。
9、加入100uL DEPC水溶解，-20℃保存。
注意：提取總RNA時，對所用與RNA有關的儀器進行DEPC處理．操作時應使用一次性手套，所用的溶液都需是RNA專用，以防RNA酶污染．
植物總RNA的提取也可采用CTAB法進行，方法如下：
1、在一50ml DEPC處理過的離心管中加入15ml CTAB植物RNA抽提緩沖液，并加入300ul β-巰基乙醇，混勻并預熱至65℃。
1、稱取2g小麥葉片，剪碎（冰浴），移入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，迅速移入加有緩沖液50ml離心管。
2、65℃水浴15min，每隔1-2min混勻一次。
3、加入等體積氯仿，振蕩10min，18℃ 1000xg離心10min。
4、取上清液于一50ml DEPC處理過的離心管中，重復步驟4。
5、取上清液于一50ml DEPC處理過的離心管中，加入1/4體積的LiCl（10M），4℃過夜。
6、4℃ 10000xg離心15min。棄上清，500ul DEPC水溶解沉淀，并轉入1.5ml RNase-Free的離心管中。
7、加入等體積氯仿，同步驟5，抽提2次。
8、加入2倍體積無水乙醇，-20℃ 2h。
10、4℃ 10000xg離心15min，吸干沉淀。視需要用100-500ul DEPC水溶解沉淀，-70℃保存。
(二) 在甲醛變性凝膠電泳分析總RNA、檢查其完整性
1、制備1%變性瓊脂糖凝膠：將0.2g瓊脂糖溶于水，加入5X甲醛凝膠電泳緩沖液4mL，稍冷卻加入37%甲醛3.4mL，混勻，使膠總體積為20mL。倒膠并放在空氣中冷卻30min．
2、50V電壓電泳，至溴酚藍移至前沿1cm處停止電泳。
3、在EB中染色15-20min，紫外燈下觀察結果。
(三)mRNA的分離與純化
1、將Oligo(dT)-cellulose裝入經DEPC處理的柱中，0.1M NaOH浸泡10min，離心除去膠中溶液(350gX2min)。
2、再用DEPC處理過的水洗2遍，每次2.0mL，然后用高鹽溶液洗至洗脫液pH<8.0。
3、總RNA在65℃加熱5min，冰上冷卻，加2倍體積的高鹽溶液于總RNA中，混勻，上柱，將溶液與膠混勻，放置10min。
4、收集流出液，重復第3步操作。
5、待溶液從柱上流出后，用高鹽溶液洗4次，每次2.0mL，用低鹽溶液洗3次每次2.0mL，收集洗脫液。
6、離心(350g* 2min)除去膠中剩余溶液，每次用0.25m1洗脫液，離心(3500*2 min)收集洗脫液，洗3次，總共約0.75mL洗脫液。
7、將洗脫液分成兩部分，分別加入0.85mL無水乙醇和0.18mL 7.5M NH4Cl，-20℃放置30min，離心(12 000gXl5rain)，用75％乙醇淋洗，抽干后置于-80℃保存。
8、50V電壓電泳，EB中染色，紫外燈下觀察結果
[實驗結果]
從小麥中提取的總RNA以及純化得到mRNA的甲醛變性凝膠電泳貫觀察：可以看出總RNA有三條帶（28S、18S、5S），而且28S條帶以上還有明顯條帶，說明總RNA還未降解。mRNA中沒有小條帶，說明mRNA也未降解。