小麥種子直接PCR

發布時間：2019-04-20 21:03 原文鏈接：小麥種子直接PCR

實驗概要

本實驗提供了小麥種子直接PCR的幾種方案。

實驗原理

小麥是世界第二大糧食作物，僅次于玉米，作為人類主食之一，對于小麥的研究由來已久。現在利用現代分子生物學手段改良小麥種子，篩選優良品種成為各大種子公司研究機構的首選。另外由于現今轉基因植物的廣泛應用以及外來生物入侵，海關檢驗檢疫部門對于轉基因，病蟲害檢測方面也需要一些快速高效的檢測手段。

Omega Bio-Tek Seed Direct PCR kit能夠快速，準確，高效，安全的從各種干燥或者新鮮植物種子中制備高質量的基因組DNA用于快速的PCR檢測，特別適合各種高通量快速檢測實驗。

實驗步驟

1. 完全不用離心和研磨操作，也不用長時間浸泡種子，只需將一粒完整的種子在裂解液中消化1-2小時即可以用來PCR檢測。（材料：新鮮或者放置不超過一年的小麥種子樣品）

方法：

1) 取1粒小麥種子放入2ml離心管中，加入95ul PS1和5ul PS2，56℃水浴1-2小時。

2) 將樣品置于90℃水浴5min，冷卻后加入100ul PS3，短暫渦旋20秒。所得抽提液可直接作為PCR反應的模板。

注：如果樣品較多，可以先將PS1和PS2按比例混合，再分裝到每個樣品管中。客戶也可以使用PCR管或者96孔PCR板代替2ml離心管，直接在PCR儀上加熱。

結果：

1) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作為50ul體系PCR擴增的模板，以植物ITS1為目標基因（上游引物：5’-AGAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’, 下游引物：5’-TCTCCGCTTATTGATATGC-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35個循環擴增約650bp左右的片段，取10% PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如下。結果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因組DNA完全可以用于PCR反應，擴增出來的目的條帶清晰，大小一致。

2) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作為50ul體系PCR擴增的模板，以小麥alpha-type gliadin 為目標基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35個循環擴增766bp的片段，取16% PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如下。結果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因組DNA完全可以用于PCR反應，擴增出來的目的條帶清晰，大小一致。

2. 完全不用離心和研磨操作，也不用長時間浸泡種子，只需將一粒完整的種子在裂解液中消化1小時，加入蛋白酶后稍微戳破小麥種子表皮，再消化1小時左右即可以用來PCR檢測。（材料：超過兩年并且特別干燥的小麥種子）

注：此類種子由于放置時間較長，表面DNA氧化降解嚴重，需要稍微破除表皮才能獲得較完整的基因組DNA。

方法：

1) 取1粒小麥種子放入2ml離心管中，加入95ul PS1，60°C水浴1小時。

2) 加入5ul PS2，并用槍頭稍微戳破小麥種子表皮，渦旋30-60秒，56°C水浴1小時。

3) 將樣品置于90°C水浴5min，冷卻后加入100ul PS3，短暫渦旋20秒。所得抽提液可直接作為PCR反應的模板。

注：如果樣品較多，可以先將PS1和PS2按比例混合，再分裝到每個樣品管中。客戶也可以使用PCR管或者96孔PCR板代替2ml離心管，直接在PCR儀上加熱

結果:

1) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作為50ul體系PCR擴增的模板，以小麥alpha-type gliadin為目標基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35個循環擴增766bp的片段，取16% PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如下。結果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的基因組DNA完全可以用于PCR反應，擴增出來的目的條帶清晰，大小一致。而使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案一抽提得到的基因組DNA用于PCR反應時有一些樣品不能得到擴增。

2) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作為50ul體系PCR擴增的模板，以小麥alpha-type gliadin為目標基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35個循環擴增766bp的片段，取16% PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如下。結果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的基因組DNA完全可以用于PCR反應，擴增出來的目的條帶清晰，大小一致。

3. 分別取1ul-10ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的DNA作為PCR模板，以小麥alpha-type gliadin 為目標基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35個循環擴增766bp的片段，取16% PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如下。結果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因組DNA足夠用于PCR擴增，且細胞裂解釋放的抑制因子經過PS3 Buffer中和以后對PCR不再有抑制作用，擴增出來的目的條帶清晰，大小一致。