5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系：
序號 反應物 劑量
1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
②PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
6 待測樣品的待測基因實時定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最后72℃7分鐘延伸。
7 實時定量PCR使用引物列表
引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
8 電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。