實時熒光定量 PCR技術原理與應用
聚合酶鏈式反應 ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過 放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經 PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術應運而生。所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖 ( 如圖 1) 。
圖 1 實時熒光擴增曲線圖
一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。 PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段， PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數被稱為 CT 值（ threshold value ）（如圖 2 所示）。
圖 2. 熒光定量標準曲線
CT 值與起始模板的關系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
圖 3 閾值線和 CT 值
熒光探針和熒光染料
實時熒光定量 PCR 的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
1．SYBR Green I
圖 4 SYBR GREEN I 工作原理
SYBR Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈 DNA 結合染料。與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm ，發射波長最大約為 520nm 。 在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。
圖 4. SYBR GREEN I 工作原理