如何選擇熒光定量檢測法之SYBRGreenI

總的說來，熒光檢測技術可大致分為兩大類：通用型的熒光染料檢測法和高特異性的熒光探針法。前者主要是利用熒光染料(如SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結合發光的特性來指示擴增產物的增加，優點是：無需另外設計熒光探針，無需特別優化條件，簡便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀，缺點是專一性不如探針法；而后者則利用熒光標記的特異性探針或者引物來識別模版，優點是特異性更高，適用于擴增序列專一檢測(見下表)，不過增加了熒光探針的成本。

除了以上這些，還有雙探針系統(bi-probe system)、BODIPY FL標記探針、Light- up探針、iFRET(induced fluorescence resonance energy transfer) 技術、Qzyme 探針和Magiprobe等等。

這么多種熒光標記方法，在選擇的時候當然要根據各人實驗設備、實驗目的以及實驗要求，還有經費來判斷了。

熒光染料

對于專一性要求不高的實驗，或者是大規模高通量的實驗，使用方便、花費較小的熒光染料可以作為你初步的選擇對象。老實說，熒光染料法實質上無非就是常規的PCR反應中添加了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結合所發出的熒光實時監控反應的進程。由于不需要設計序列特異性探針和優化反應條件，價格低廉，通用性強，而且熒光染料法可用于任何一種型號的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。熒光染料法的專一性和PCR沒有本質的區別---但是作為“失之毫厘，謬之千里”高度精確的實驗，你依然可以選擇更好的熒光染料、更嚴謹專一的PCR酶、更好的緩沖體系來提高反應的可靠程度。

在熒光染料法的定量PCR反應試劑中，最常用的是SYBR Green I，這種高靈敏度，較低毒性的核酸染料最大激發波長497nm，最大發射波長是520nm，在結合雙鏈DNA分子后熒光增強800-1000倍，靈敏度較EB更高，毒性較EB低，可避免EB對于小分子量DNA靈敏度較低，而在監測大分子量DNA區域可能會出現背景色等等弱點，因此經過時間的篩選漸漸成為了定量PCR熒光染料的“當家花旦”。

在PCR反應體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號顯著增強；當DNA變性時SYBR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產物，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，經檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

熒光染料可以在反應末尾對擴增產物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產物溶解點緩慢升到高于產物溶解點，定量PCR儀連續監測每個樣品的熒光值。基于產物長度和G/C含量的不同，擴增產物會在不同的溫度點解鏈。隨著產物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應中擴增到的產物，因此用溶解曲線數據就可以進行定量監督了。

SYBR的主要優勢：

安全性：SYBR染料的致突變性遠低于EB數倍甚至數十倍(取決于不同受檢物種或株系)

超高靈敏度：具有1000倍以上的熒光增強效果和0.6的量子產量；與此相比，EB只有大約30倍的熒光增強效果和0.15的量子產量。因此，SYBR Gold檢測核酸的靈敏度是EB的十倍以上。(這主要是因為SYBRGreen是和DNA小溝結合，而EB則是嵌入到堿基之間)

使用電泳后染色程序可提高靈敏度，而滲透入凝膠的速度極快。

通用性：可在各種類型的凝膠如高濃度瓊脂糖、乙二醛瓊脂糖、甲酰胺瓊脂糖、聚丙烯酰胺和尿素-聚丙烯酰胺凝膠中檢測雙鏈DNA。

簡便易用：只須將凝膠在染色液中保溫10-40分鐘(取決于凝膠的厚度和濃度)，無須脫色，背景極低。

與其他分子生物學技術兼容：對酶切、連接和PCR反應都沒有影響。

與常規儀器兼容：可用300-495nm的任何類型的光源激發。

適合高通量大規模的定量PCR檢測。

使用濃度對熒光PCR結果的影響：

SYBR Green I 的使用濃度是影響實驗成功與否的關鍵因素，如果SYBR Green I的濃度不飽和會使熒光信號不能反應產物量的變化。而過高濃度則會抑制PCR反應，降低PCR反應效率。通常試劑盒會有比較現成的方案。提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應的抑制作用。在用SYBR Green I進行熒光PCR反應時， 鎂離子濃度要比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應要高(0.5-2mM)。

缺點：

然而雖然SYBR Green熒光染料可以用來監測各種雙鏈DNA序列的擴增，靈活性高是它的優點，但是正如一個硬幣有兩面，通用性高就意味著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結合，因此DNA引物二聚體(primer-dimers)或其它非特異擴增產物(spurious PCR)可以對定量結果產生干擾(導致低Ct值)，同時也降低了反應的專一性和可重復性---而這一點對于定量PCR分析十分重要。

舍不得SYBR Green I的方便、通用、便宜的優點，又希望提高其專一性，許多人做了不少嘗試：比如仔細的設計引物和純化模板、比如使用能分析產物熔解曲線的軟件可以解決引物二聚體的問題選擇，還有就是采用嚴格熱啟動的擴增酶減少非特異擴增、采用特定的緩沖系統減少引物二聚體和錯配形成、采用修飾堿基減少二級結構或者改變穩定性、在Tm值以上進行熒光測定減少引物二聚體的影響等等。提高PCR的特異性已經是老大難問題了，對于貪圖方便、便宜的實驗新手來說不一定能考慮周全，這也就是為什么許多希望能通過在普通PCR基礎上摸索條件，自己完成定量PCR檢測的研究人員發現結果不理想的主要原因之一。因此，不少生物技術公司針對熒光染料特異性缺點使出了各家的法寶，提出了有建設性和有新意的解決方案也讓這個熒光檢測技術繼續煥發光彩。