如何獲得cDNA

cDNA的獲取方法：

1.用親和層析法得到 mRNA 后，根據 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾結構的原理，用 12~20 個核苷酸長的 oligo 與純化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）會與 poly (A) 結合作為反轉錄酶的引物，隨機引物法合成的產物也是 RNA-DNA 的雜交體。把 cDNA 克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的 RNA 轉變成 DNA 鏈，即形成雙鏈 DNA 分子。

2.利用 cDNA 第一鏈的 3' 末端常常出現發夾環的特征，這種發夾結構是反轉錄酶在第一鏈末端“返折”并且進行復制第一鏈的結果，用這種方法合成的雙鏈 cDNA 在一端有一個發夾環，可以用單鏈特異的 S1 核酸酶切去。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的 DNA 鏈。 RNase H 法優于 S1 核酸酶法，它能獲得包括 mRNA 5' 端全部或絕大部分的更長順序 cDNA 分子。

cDNA簡介：

為具有與某mRNA(信使RNA)鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementary DNA之縮寫，或此DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的DNA鏈所形成的DNA雙鏈。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)的作用而合成，并且在合成單鏈cDNA后，在用堿處理除去與其對應的RNA以后，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶的作用合成雙鏈cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遺傳工程方面廣為應用。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來基因的DNA(基因組DNA，genomic DNA)不同而無內含子;相反地對應于在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，與exon序列、先導序列以及后續序列等一起反映出mRNA結構。