基因診斷是指檢測感染者體內病毒核酸的有無,或含量多少來進行病原學診斷的一類方法,它可用在各種感染性疾病的診斷中,尤其在病毒性肝炎的診斷得到廣泛應用。病毒性肝炎基因診斷包括病毒基因種類及含量、基因分型、亞型和變異及準種等的診斷。由于甲型肝炎和戊型肝炎無慢性化,且有較好的血清學診斷指標,故一般不需進行基因診斷。至于HGV和TTV,因至今未能明確其對人類的致病性,基因診斷在臨床上也較少應用,目前主要用在基礎和實驗研究中,為此,僅對基因診斷在慢性乙型肝炎和丙型肝炎中的應用加以切磋。
由于乙型肝炎病毒抗原,特別是表面抗原,在血液中的濃度較高,現癥HBV感染通過抗原檢測,特別是在使用通過批批檢的試劑時,即能明確診斷。雖然有國外作者報道,血清學檢測僅抗HBc單項陽性,也可在血清中檢測到 HBV DNA,但此類患者畢竟少之又少。因此,乙型肝炎的診斷往往不需要進行病毒核酸的檢測。但在對患者進行抗病毒治療時,血清中的病毒核酸含量是反映病毒數量和復制活躍程度最可靠的直接指標,因此,病毒含量的檢測顯得必不可少,它是反映動態觀察藥物療效的確切指標,特別是對于HBeAg陰性患者。另外,對于丙型肝炎病毒感染的診斷,現行的第三代血清學檢測試劑雖有較好的敏感性和特異性,但約有20%患者可不出現抗體,或有的患者抗體存在時間可以很長,因此,對其進行病毒核酸的檢測以明確是否存在現行感染,是非常必要的。HCV感染后,由于抗體出現的較晚,要早期診斷也只有進行核酸的檢測。因此,核酸檢測在HCV感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多。
最初臨床上應用最多的HBV DNA檢測方法為斑點雜交,它有較好的穩定性和特異性,也不需要昂貴的設備,但它是一種定性檢查,且敏感性較低(檢測敏感度約在105copies/ml以上),在一定范圍內不能反映出病毒含量的變化,隨著PCR檢測技術的發展日趨成熟,臨床應用斑點雜交檢測法越來越少。HCV在血液中的含量很低,且屬RNA病毒,因此不能用斑點雜交檢測。
從1989年成功應用PCR檢測出HCV RNA以來,PCR定性檢測技術在臨床和科研領域得到廣泛的應用。在HBV感染的診斷中,由于HBsAg容易檢測,PCR定性檢測意義有限。但在HCV的診斷中,由于目前不能檢測抗原,要明確是否為現行病毒感染,很有必要進行PCR檢測。PCR方法具有敏感性高,可檢測出極微量的核酸,理論上能檢測出一個拷貝的基因。因存在操作技術等方面的影響,其實際敏感性一般在幾百個copies/ml左右。由于影響PCR測定的因素頗多,常易出現假陽性和假陰性結果，因此，必須根據臨床上的其他資料，進行綜合分析。
有作者在臨床上采用血清系列稀釋法檢測最高稀釋血清中的病毒核酸，它可測定單一個體抗病毒治療前后血清中核酸的變化以監測抗病毒的藥物療效，但不能對個體之間進行比較，難于標準化，而且費時費力，因此不能廣泛應用于臨床。斑點雜交和PCR定性均不能反映病毒含量的動態變化，難以對抗病毒藥物的療效作出確切的判斷。90年代初，由Chiron公司推出了第一代支鏈DNA（bDNA）檢測試劑，其線性范圍為105－109Eq/ml。bDNA檢測的敏感性在HBV為1000copies/ml以上，而在HCV檢測其最低限度為4.8×104copies/ml。雖然它能反映血液中病毒含量的變化，但試劑價格十分昂貴，在HBV DNA定量檢測中，線性范圍的下限較高,HCV RNA的定量檢測中敏感性不夠,難于在臨床上廣泛應用。90年代后期,Digene公司推出了第二代雜交捕獲法檢測HBV DNA的試劑,通過化學發光捕獲法和信號放大技術檢測HBV DNA含量,敏感范國在5×lO3-9copies/ml,且檢測時間短,批內和批間變異小,特異性高,應當說較適用于臨床的HBV DNA定量檢測,但目前尚未推廣應用。
現今發展成熟的實時定量PCR方法,應當說具有省時,費用相對較低,而且能反映血液中病毒核酸的確切數量等優點,目前也正在臨床上廣泛應用。但不同的檢測系統的敏感性,即檢測的最低病毒核酸量仍有差異。同樣也存在因測定操作而出現的誤差,有時誤差還是較大的,此時往往要觀察病毒核酸變化的趨勢,以對臨床結果做出正確判斷。在臨床對病毒性肝炎的治療中，定性和定量PCR測定的應用不能混淆。定性檢測主要是用于未知感染者的診斷,確定患者是否感染了肝炎病毒,結果分別報告為"陽性"或"陰性"。而定量測定主要用于己知感染者的抗病毒治療時動態觀察療效,結果報告需以量來表示。如高出定量范圍上限，則需對標本稀釋后再測,低于定量范圍下限時,則報告小于××copies/ml,不能以"陰性"形式報告。
對于定量檢測PCR 時,監控用抗病毒藥物治療后,血清中病毒含量逐步下降，但一般不應得出陰性報告,因為在重復多點隨機分布結果不會降到零,達不到陰性,而當前有不少報告卻為陰性,所以建議用大量樣本追蹤,來研究出準確的報告方法,以作臨床常規使用。
關于長期使用賀普丁治療HBV DNA陽性的患者必須用PCR來測定是否產生YMDD變異,早期采用測序的方法,但操作復雜,成本高,還不能廣泛應用。我所采用引入YIDD,和YVDD特異性酶切位點的PCR技術,可準確的檢出血清中YIDD及YVDD變異,與測序結果完全相符。該方法成本低,適合臨床用于監控抗病毒治療。
嚴格質控是作好PCR的前提,衛生部臨床檢驗中心已多次培訓強調,但最近才得到獲批準的國際標準品,作為我國統一的室內質控準品正在研制中,所以現在各生產廠家PCR試劑中的標準品都為自制。HCV RNA病毒在作PCR 時必須要經過逆轉錄,而廠家所用的標準品為HCV cDNA,未考慮逆轉錄時對測定結果的影響。因而可比性較差。這種定量測定的可靠性值得懷疑，建議盡快建立適合我國的標準品。
目前不少臨床大夫以及患者反映,定量PCR檢測結果與患者血清學標志物結果不相符合的問題,除了上面諸因素外,尚存在對檢測指標如何分析的問題，因為PCR是檢測病毒核酸水平,而血清學指標是檢測病毒蛋白,二者不在一個水平上,也就是說二者測定不是-個物體,理論上允許有差別。如大三陽患者可能出現PCR陰性,如何對待抗病毒治療,必須綜合分析,動態觀察結果,不能只依靠一個指標來診斷，當然對試驗本身必須做到準確無誤，必要時重復多次，不同廠家試劑的對比，盡量避免假陽性或假陰性。
HBV/HCV的基因變異時客觀存在的，其檢測對分子流行病學調查很有實用價值，用某些藥物治療也可促進變異發生，甚至變異后會產生抗藥性。目前抗病毒藥物的應用臨床上種類不多，持續用藥時間也不長，有待進行更多、更長、更廣泛的研究，才能得出有價值的結論。例如用拉米夫定治療慢性乙肝，會產生一定的YMDD等的基因變異，但有不少研究認為在用藥前也有少數患者已經存在變異，與用藥有無關系不好定論，一定要通過大樣本的深入長期研究，才能指導臨床。
有關基因芯片、生物芯片技術用在病毒性肝炎診斷，已有初露頭角，這僅是為了檢測程序及快速出報告的技術革新，并沒有原理上及質的變化。用在某一疾病上的芯片搭配，如所有病毒性肝炎基因或病原體抗原，沒有必要一次性幾十個指標組成，這樣不僅造成浪費，而且更難統一，至少目前用在常規診斷上為時過早。
在肝炎病毒的核酸診斷中還有病毒分型、亞型、基因變異和藥物敏感基因的篩選等，在臨床上這些檢測的意義，對用藥有指導作用。在不同的研究者的研究結果不盡相同，這可能與各地區肝炎病毒的基因有差別，所選病例不同，和檢測結果本身固有的差異所致。這些檢測的費用均不低，技術操作復雜，難于廣泛應用臨床。
總之，核酸診斷是分子生物學技術發展的結果，但必須做到操作的規范化，嚴格掌握應用范圍，并且和臨床的其他資料的分析相結合，才能正確判斷檢測結果。