活性氧 (Reactive oxygen species，ROS) 是一類由細胞有氧代謝產生的具有化學反應活性的一類含氧分子，參與細胞信號轉導、免疫防御以及維持體內動態平衡等各項生理活動。然而當細胞處于環境壓力時，胞內的ROS 含量水平就會急劇上升造成核酸、蛋白和脂類物質的氧化損傷[1]， 從而引起許多生理、病理變化，諸如男性不育、癌癥的發生等等[2]。
胞內 ROS 含量水平通常采用熒光探針，尤其綠色熒光探針來檢測。然而由于綠色熒光檢測和成像易受細胞自發熒光的影響[3]， 因此遠/近紅外染料常被用來檢測 ROS 含量從而避免細胞自發熒光的干擾。
SpectraMax? iD5 多功能微孔讀板機采用超冷型 PMT 和“2X2”光柵光路設計，可有效降低信號背景減少雜散光，為遠紅外熒光檢測提供更寬的動態范圍和更高的靈敏度。
這里我們展示的是如何利用 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機和 2 個熒光檢測試劑盒來進行胞內 ROS 含量分析的。在 Spectral Optimization Wizard 幫助下，我們優化了遠紅外分析檢測下激發光和發射光的不同波長組合，并最終比較了綠色熒光檢測 和遠紅外熒光檢測結果的表現
優勢
? 一步均相熒光法可快速檢測胞內活性氧
? 超冷型 PMT 可進一步降低背景噪聲并增強實驗表現
? Spectral Optimization Wizard 可優化激發和發射光波長
材料
? Cell Meter? 熒光胞內總 ROS 活性檢測試劑盒 *深紅色熒光* (AAT Bioquest cat. #22903)
? Cell Meter? 熒光胞內總 ROS 活性檢測試劑盒 *綠色熒光* (AAT Bioquest cat. #22900)
? HEK293 細胞 (AATC cat. #CRL-1573)
? 甲萘醌 (Sigma cat. #M9429-25G)
? 96 孔組織培養板，黑邊底透 (Greiner cat. #655087)
? SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機 (Molecular Devices cat. #iD5)
方法
HEK 293 細胞鋪板于 96 孔細胞培養板中， 每孔 1 萬個細胞，37 ℃ 培養 24 小時。隨后細胞經甲萘醌濃度梯度處理 1 個小時， 甲萘醌起始濃度為 25 μM，倍比稀釋系數為 2。最后細胞經 Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑或 Cell Meter 綠色熒光 ROS 檢測試劑處理，37 ℃ 培養 30 分鐘。
由于 Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑 盒所推薦的激發光和發射光波長相距太近 (658/675 nm)，與 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機不太兼容，因此本實驗激發 /發射采用預估的 625/700 nm，以便激發 /發射帶寬有足夠距離且產生足夠的熒光信號 ( 圖 1 )。
SoftMax? Pro 軟件的 Spectral Optimization Wizard 能夠為遠紅外分析自動計算出更合適的激發/發射波長，Read Height Optimization 設置能夠找出更合適的的讀板高度。實驗所用的波長和 PMT 增益設置如表 1 所示，數據和圖片均采用 SoftMax? Pro 軟件產生。
結果
甲萘醌通過阻斷線粒體電子傳遞鏈的不同部分使得胞內 ROS 含量積聚[4]，因此當其濃度增加時胞內的 ROS 含量也會相應增加。Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑盒和綠色熒光 ROS 檢測試劑盒都能夠得出甲萘醌劑量反應曲線 并且有相似的 EC50 ( 圖 2、3 )遠紅外分析所用的激發/發射波長經 Spectral Optimization Wizard 優化，可獲得本次實驗中最優的 Z 因 子 ( 表 2 )。
結論
對于胞內熒光檢測 ROS 含量實驗來說， 使用 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機結合 SoftMax? Pro 分析軟件是一個非常有力的手段。軟件中的 Spectral Optimization Wizard 和 Read Height Optimization 能自動優化實驗條件以獲得更好的實驗結果。盡管 SpectraMax iD5 能夠有效對胞內 ROS 含量進行綠色熒光檢測和遠紅外熒光檢測，然而后者結合激發/發射波長優化設置表現出較前者更為優異的 Z 因子。
References
1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways." Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50.
2. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade in?ammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi:10.1186/ 1742-4933-5-13.
3. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new ?uorescent proteins brighten the infrared scene." Nature Methods 8.9 (2011): 726.
4. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinski?. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DTdiaphorase function." Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991):1779 -1786.