天然產物中多糖的分離、純化與鑒定(2)

二、粗多糖的純化
粗多糖溶液加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇＝3：1混合搖勻)后，置恒溫振蕩器中震蕩過夜，使蛋白質充分沉淀，離心(3000r／min)分離，去除蛋白質。然后濃縮，透析，加入4倍體積的乙醇沉淀多糖，將沉淀凍干。
取樣品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡緩沖液中。上樣，用Buffer A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 進行線性洗脫，分部收集。各管用硫酸苯酚法檢測多糖。合并多糖高峰部分，濃縮后透析，凍干，即得多糖級分。

第二部分多糖的鑒定
目的要求
（1）了解薄層層析法分析單糖組分的原理和方法。
（2）了解紅外光譜法鑒定多糖的原理和方法。
實驗原理
采用薄層層析法分析單糖組分。薄層層析顯色后，比較多糖水解所得單糖斑點的顏色和Rf值與不同單糖標樣參考斑點的顏色和Rf值，確定樣品多糖的單糖組分。
多糖的分析鑒定一般借助于氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜 (IR)和紫外光譜(UV)等技術，氣相(液相)色譜—質譜(GC／HPLC—MS)聯用技術成為分析多糖更為有效的手段。
本實驗利用紅外光譜對多糖進行鑒定。多糖類物質的官能團在紅外譜圖上表現為相應的特征吸收峰，我們可以根據其特征吸收來鑒定糖類物質。0—H的吸收峰在3650—3590cm－1，C—H的I申縮振動的吸收峰在2962—2853cm－1，C＝O的振動峰為1510 —1670－1之間的吸收峰，C—H的彎曲振動吸收峰為1485—1445cm－1，毗喃環結構的C—0的吸收峰為1090cm－1。
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸，氫氧化鋇。
展開劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶＝7：20：12：7：6：6。
顯色劑:1，3－二羥基萘硫酸溶液（0.2％1，3－二羥基萘乙醇溶液）：濃硫酸＝1：0.04（V/V）。
單糖標準品。
二、器材
沸水浴, 玻璃板，傅里葉變換紅外光譜。
操作方法
一、單糖組分分析
1．薄層板制備：稱取硅膠5g于50ml燒杯中，加入用 12 mL 0.3mol／L 磷酸二氫鈉水溶，用玻璃棒慢慢攪拌至硅膠分散均勻，鋪在玻璃板上(7．5cm×10cm)，110℃活化1h。即置有干燥劑的干燥箱中備用。
2．點樣：稱取少許的多糖(0．1克)于2．0mL離心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氫氧化鋇中和至中性，過濾除去硫酸鋇沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和單糖標準品進行點樣進行薄層層析展開。用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，點樣直徑為2—4mm，點間距離約為1.5—2.0cm，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。
3．展開：展開室如需預先用展開劑飽和，將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5—1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封室蓋，等展開至規定距離（一般為10—15cm），取出薄層板，晾干。
4．顯色：將展開涼干后的薄板再在100℃烘箱內烘烤30分鐘，將顯色劑均勻地噴灑在薄板上，此板在110℃下烘烤10分鐘即可顯色。
薄層顯色后，將樣品圖譜與標準樣圖譜進行比較，參考斑點顏色、相對位置及Rf值，確定樣品中有哪幾種糖。
二、紅外光譜在多糖分析上的應用
將凍干后的樣品用KBr壓片，在4000～400cm-1區間內進行紅外光譜掃描，有如下的多糖特征吸收峰：3401 cm-1（O-H），2919 cm-1(C-H), 1381 cm-1及1076 cm-1（C-O）。在900 cm-1處的吸收峰說明該多糖以β-糖苷鍵連接。在N－H變角振動區1650-1550cm-1處有明顯的蛋白質吸收峰，表明該樣品是多糖蛋白質復合物。