大鼠MSCs的獲得和擴增實驗—大鼠骨髓原代培養用于MSCs生產

大鼠骨髓

滅菌CCM含0.2μg ml兩性霉素B(兩性霉素B洗劑)非滅菌0.85%臺盼藍鹽溶液PBSA

聚丙烯離心管 15 ml或50 ml塑料組織培養Petri培養皿 直徑15 cm改良的Neubauer血細胞計數器

(a)從一根股骨所得的骨髓懸液中取出10μL，與l0μL臺盼藍混合。評估存活率，確保髙于80%。

(b)1000 g離心10 min沉淀骨髓。

(c)用25 ml預熱的含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓（處理大鼠骨髓細胞使用抗真菌藥物，人骨髓細胞不使用）。

(d)將25 ml細胞懸液加人到15 cm直徑的組織培養板中，37℃，5% CO₂環境下至少孵育15 h。

(e)從培養箱中取出培養板，吸出培養基。

(f)用20 ml預熱的PBSA潤洗單層細胞。重復潤洗過程3次，將最后的洗滌產物加人30 ml預熱的含抗菌藥物的新鮮CCM中（只有大鼠細胞使用抗真菌藥物）。

(g)如有需要每隔兩天重復步驟(f)維持6?14天。

(h)每3天用倒置顯微鏡觀察單層細胞。貼壁、成纖維細胞樣的MSCs集落可以在培養板中清晰可見。某些情況下，這可能是造血細胞污染的信號，但這些細胞隨著細胞傳代過程可被去除。當培養物達到40%?50%匯合時進行處理。這些MSCs標記為0代。