大鼠卵巢顆粒細胞的原代培養與鑒定
許 川1/舒為群1,/張 亮1/曹 佳2/周 新3
(1.第三軍醫大學軍事預防醫學院環境衛生學教研室, 重慶 400038； 2. 第三軍醫大學軍事預防醫學院軍事毒理學教研室，重慶 400038；3. 第三軍醫大學西南醫院燒傷科， 重慶 400038)
Culture and Identification of Granulosa Cells from Rat Ovary
XU Chuan1, SHU Wei-qun1,, ZHANG Liang1, CAO Jia2, ZHOU Xin3
(1. Department of Environmental Hygiene, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 2. Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 3.Institute of Burn Research， Southwestern Hospital，Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
【摘要】 背景與目的： 探討大鼠卵巢高純度顆粒細胞培養及鑒定的方法，建立一種簡便、穩定的細胞模型。材料與方法： 選用SD雌性大鼠(21～25 d)，皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后用頸椎脫臼法處死，剖取雙側卵巢，采用機械分離方法釋放卵巢顆粒細胞，0.25％胰蛋白酶消化結合低速離心分離細胞，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37 ℃，5％ CO2培養箱培養。以HE染色和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫組化染色對所培養的卵巢顆粒細胞進行鑒定，用MTT法繪制細胞生長曲線，并檢測細胞培養液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 結果： 分離培養的卵巢顆粒細胞存活率>90％，細胞純度達到95％以上；體外培養的顆粒細胞對數生長期為48～96 h；顆粒細胞具有正常的分泌雌激素功能，在培養24 h細胞培養液中E2和P的分泌量分別為(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 結論： 采用機械分離法結合胰蛋白酶消化及低速離心法分離培養的卵巢顆粒細胞純度高、活性好，用FSHR表達染色鑒定顆粒細胞是一種簡便快速的方法。
【關鍵詞】 大鼠； 卵巢； 顆粒細胞； 培養； 鑒定
中圖分類號：R730.45文獻標識碼： A 文章編號：1004－616X(2009)03－0234－04
【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM: To obtain and identify cultured granulosa cells from the ovary of rats so as to establish a convenient and stable experimental model. MATERIALS AND METHODS: Female SD rats were subcutaneously treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). Forty-eight hours after dosing with PMSG, the animals were decapitated and the ovaries were aseptically removed. Granulosa cells were then released by mechanical method, trypsin digestion and low-speed centrifugation separation were used for granulosa cells isolation. Granulosa cells were diluted and incubated in fresh DMEM-Ham's F-12 medium (1∶1) containing 15％ of fetal bovine serum at 37 ℃ in water-saturated environment of 5％ CO2. Hematoxylin ＆ Eosin (HE) and immunohistochemical staining of FSHR were used for ovarian granulosa cell identification. Additionally, the growth curves of granulosa cells and hormone levels at different incubation times were evaluated as well. RESULTS: Over 95％ of the cultured cells were ovarian granulosa cells．The exponential phase of growth was between 48 and 96 hours of incubation. CONCLUSION: More than 95％ of highly purified granulosa cells could be obtained by mechanical method combined with trypsin digestion and low-speed centrifugation. Moreover, identifications of granulosa cells by HE and FSHR staining were quick and convenient approaches.
【KEY WORDS】 rat; ovary; granulosa cell; culture; identification
顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動[1－2]。環境中有毒有害物質對人和哺乳動物的生殖毒害和機制至今仍在探索中，進行顆粒細胞體外培養是研究化學毒物生殖毒性的基礎，是探索卵巢內分泌功能及調控機制的重要手段，而如何獲得高質量的顆粒細胞是生殖毒理學研究深入的關鍵。
盡管國內外有關哺乳動物卵巢顆粒細胞的體外培養已有文獻報道[3－5]，但迄今為止，尚無明確標準、高效、穩定的的培養方法，本研究旨在通過改進和完善顆粒細胞的體外培養和鑒定方法，為進一步開展顆粒細胞體外生殖毒理學研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
DMEM/F12培養基購自美國HyClone公司，無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司, 孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自杭州動物藥品廠，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，DAB顯色試劑盒、卵泡刺激素受體(FSHR)兔多克隆抗體購自武漢博士德公司，伊紅、蘇木素購自北京中杉金橋生物工程有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫測定試劑盒購自北京原子高科股份有限公司。
主要儀器包括組織培養顯微鏡，光學顯微鏡(Olympus)，CO2培養箱(Thermo Forma)，全自動酶標儀(Thermo)，離心機(湖南湘儀)，GC-911 γ放射免疫計數器(中佳光電儀器分公司)等。
1.2 實驗動物
21～25日齡(50～60 g)清潔級健康SD大鼠10只，雌性，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。
1.3 卵巢顆粒細胞的分離與原代培養
參照Lovekamp等[3]介紹的方法加以改進，雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 40 IU，48 h后頸椎脫臼法處死。碘伏、酒精消毒，在無菌條件下迅速剖取卵巢放入預冷的無菌PBS中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于預冷的DMEM/F12培養基中。在解剖顯微鏡下用25號針頭刺破卵泡，使顆粒細胞釋放入 DMEM/F12培養基，離心管內吹打分散成單個懸浮細胞。加入0.25％胰蛋白酶－0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，于37 ℃，5％ CO2培養箱中消化60 min，期間從培養箱取出用吸管反復吹打懸液2～3次(以組織消化為黏液狀、顆粒細胞團塊分離為準)，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，200目不銹鋼細胞篩過濾。800 r/min離心5 min，洗滌濾液，棄上清收集細胞。向沉積在離心管底的疏松細胞團中加入DMEM/F12培養基(含15％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素) 制成單細胞懸液。臺盼藍染色，計數。將細胞稀釋成濃度為3.0×105/ml的細胞懸液，接種于培養瓶中或培養板中，在37 ℃、5％ CO2培養箱中預培養24 h后換液1次，去除未貼壁細胞；此后隔日換液1次。