大腸桿菌轉化實驗——高效率電轉化法

大腸桿菌

LBSOC

電轉化儀離心機分光光度計

1.  接種一個單菌落于5 ml LB培養液，37℃溫和振搖培養5 h 或過夜。

2.   將2.5 ml 培養物加人到盛有500 ml LB培養液的2 L 燒瓶中，37℃搖勻振蕩培養至OD₆₀₀為0.5~0.6。

3.  細菌在冰水浴冷卻10~15 min，然后轉移到預冷的1升離心瓶中。于2℃，5 000 g 離心20 min 沉淀用5 ml 預冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水，混勻，按步驟3重復離心1次，立即將上清倒掉，用殘余的液體重懸細胞。

5.  新鮮制得的細菌

（1）將懸浮液加入到預冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃，5 000 g 離心10 min。

（2）估計細胞沉淀的體積，沉淀用等體積的冰冷水重懸。

（3）按50~300 ul 分裝于預冷的微量離心管中。

6.  凍存細菌

（1）加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合，然后按照步驟5離心。

（2）估計沉淀的體積，然后加入等體積的冰冷的10%甘油，重懸菌體。

（3）按50~300 ul 分裝于預冷的微量離心管中。

（4）于干冰上冷凍并貯存于-80℃。

7.  將電轉化儀調到2.5 kV、 25 uF ，脈沖控制器調到200~400Ω;。

8.  將1 ul 質粒DNA加入到盛有新鮮制備的細菌或融化的凍存細菌的小管中，混勻。

9.  將轉化混合物轉移到預冷的電轉化池中，吸干池的外表面，然后放入樣品槽中。
 

10.  進行脈沖電轉化，然后取出電轉化池，馬上加入1 ml SOC培養液，并且用巴斯德吸管轉移到無菌的培養管中。

11.  于37℃，中速振蕩培養30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。