多重 PCR反應的基本原理
DNA 引物（步驟 1 和 2 ） . 引物的選擇遵從簡單的規則：引物長度為 18-24bp 或更長， GC 含量為 35%-60% ，退火溫度 55 ℃ -58 ℃或更高。長些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反應在更高的退火溫度下進行并產生較少的非特 異性產物。使用軟件 Primers 1.29( 從 ftp.bio.indiana.edu 下載的免費軟件 ) 來計算熔點并檢測可能的引物間的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列數據庫中對多對引物進行比對，以檢測可能的重復序列。
單基因的 PCR( 步驟 3). 首先設計了一個分別單獨擴增所有基因的 PCR 程序。反應混合物包括： 1xPCR 緩沖液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反應體積。將在同一臺 PCR 儀，在同型號的不同 PCR 儀上，在不同型號 PCR 儀上及在不同制造商的 PCR 儀上進行的擴增反應結果進行比較。在同一臺 PCR 儀上或在同型號的不同 PCR 儀上擴增，實驗的重復性很好，但在不同制造商的 PCR 儀上進行的擴增反應結果有明顯差異，但是通過對循環條件的調節可以得到好的重復性。實驗表明對于 100-300bp 的基因擴增產物，通過降低延伸溫度可以增加某些產物的產量。對于單一 PCR 反應，退火時間與延伸時間并不明顯影響結果，但改變退火溫度可以改變 PCR 產物的特異性和產量。對于擴增 22Y 特異基因 (Figure 2a) ， PCR 程序 A 得到最佳結果 (Table 2) 。
多重 PCR ：等物質量的引物混合物（步驟 4 ） . 將引物以各種方式混合在同一反應中同時擴增多個基因要求對某些反應參數進行改變或優化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次進行多重反應時，各種引物按相等的摩爾數添加是很有必要的。結果將會揭示哪些引物的濃度或是哪些參數需要改變。下面將解釋并討論一些優化的例子，由于許多參數被提及不止一次，因此這些例子并未嚴格遵照 Figure 1 中所列的步驟。