多藥抗藥基因的表達實驗——PCR擴增法

大多MDR細胞膜上出現MDR-1基因及其基因產物P-糖蛋白過度表達。 多藥抗藥基因的表達實驗是通過反轉錄和PCR的方法來檢測這些特定基因的過度表達。

RNA

PBS氯仿異丙醇萘酸異硫氰酸肽十二烷基肌酸鈉構櫞酸鈉乙酸鈉二疏基乙醇乙醇Taq酶

離心機紫外分光光度計瓊脂糖凝膠電泳PCR儀

一、細胞總RNA提取

1.  收集約5x10⁷個細胞，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A₂₆₀/A₂₈₀應為1.8~2.0）后備用。

二、反轉錄及PCR擴增

1.  引物
 

2.  取細胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉錄酶反應體系中，42℃保溫30 min 進行反轉錄，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉錄。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，對cDNA上的目的片段進行PCR

5.  94℃預變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增35個循環。

6.  最終在60℃保溫7 min，以保證產物充分延伸。

7.  取10 ul 擴增產物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。

1. 盡可能在低溫下操作；

2. 適量斟酌Trizon等的用量；

3. 在每一次離心后除盡蛋白質、不溶物

提取操作時必須戴手套、口罩等防止DNA酶的影響；

4. 注意Trizon帶有腐蝕性；

5. 最重要的就是防止DNase的污染，手套、口罩必不可少，所用的槍頭和EP管等也要RNA提取專用的，無DNA酶的。