多管發酵法測定水中大腸菌群實驗

實驗方法原理 多管發酵法包括初（步）發酵試驗、平板分離和復發酵試驗三個部分。

1. 初（步）發酵試驗

發酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發酵乳糖，而大腸菌群能發酵乳糖而產酸產氣。為便于觀察細菌的產酸情況，培養基內加有溴甲酚紫作為 pH 指示劑，細菌產酸后，培養基即由原來的紫色變為黃色。溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。

水樣接種于發酵管內，37℃ 下培養，24 h 內小套管中有氣體形成，并且培養基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產氣；此外產酸不產氣的也不能完全說明是陰性結果。在量少的情況下，也可能延遲到 48 h 后才產氣，此時應視為可疑結果，因此，以上兩種結果均需繼續做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。48 h 后仍不產氣的為陰性結果。

2. 平板分離

平板培養基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養基，Endo's medium）或伊紅美藍瓊脂（eosin methylene blue agar，EMB agar），前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養基中的亞硫酸鈉脫色，使培養基呈淡粉紅色，大腸菌群發酵乳糖后產生的酸和乙醛即和復紅反應，形成深紅色復合物，使大腸菌群菌落變為帶金屬光澤的深紅色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發酵乳糖造成酸性環境時，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產生與遠藤氏培養基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發酵管 24 h 內產酸產氣和 48 h 產酸產氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。

3. 復發酵試驗

以上大腸菌群陽性菌落，經涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發酵試驗相同，經 24 h 培養產酸又產氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。

實驗材料 待檢水樣

試劑、試劑盒 乳糖蛋白胨發酵管三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管（瓶）伊紅美藍瓊脂平板滅菌水

儀器、耗材 載玻片滅菌帶玻璃塞空瓶滅菌吸管滅菌試管

實驗步驟

1. 水樣的采取（見「水中細菌總數的測定」實驗）

2. 自來水檢查

2.1 初（步）發酵試驗

在 2 個含有 50 ml 三倍濃縮的乳糖蛋白胨發酵燒瓶中，各加入 100 ml 水樣。在 10 支含有 5 ml 三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管中，各加入 10 ml 水樣（如圖 1）。混勻后，37℃ 培養 24 h，24 h 未產氣的繼續培養至 48 h。

圖 1　多管發酵法測定水中大腸菌群的操作步驟和結果解釋

2.2 平板分離

經 24 h 培養后，將產酸產氣及 48 h 產酸產氣的發酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于 37℃ 下培養 18～24 h，將符合下列特征的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2.1 深紫黑色、有金屬光澤。

2.2.2 紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。

2.2.3 淡紫紅色、中心顏色較深。

2.3 復發酵試驗

經涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發酵管中，每管可接種來自同一初發酵管的同類型菌落 1～3 個， 37 ℃ 培養 24 h，結果若產酸又產氣，即證實有大腸菌群存在。

證實有大腸菌群存在后，再根據初發酵試驗的陽性管（瓶）數查表 1，即得大腸菌群數。

表1　大腸菌群檢表數
接種水樣總量 300 ml（100 ml 2 份，10 ml 10 份）

3. 池水、河水或湖水等的檢查

3.1 將水樣稀釋成 10^-1 與 10^-2 。

3.2 分別吸取 1 ml 10^-2 、10^-1 的稀釋水樣和 1 ml 原水樣，各入裝有 10 ml 普通濃度乳糖蛋白胨發酵管中。另取 10 ml 和 100 ml 原水樣，分別注入裝有 5 ml 和 50 ml 三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵液的試管（瓶）中。

3.3 以下步驟同上述自來水的平板分離和復發酵試驗。

3.4 將 100、10、1、0.1（10^-1）ml 水樣的發酵管結果查表 2，將 10、1、0.1（10^-1）、0.01（10^-2）ml 水樣的發酵管結果查表 3，即得每升水樣中的大腸菌數。

表 2　大腸菌群檢數表
接種水樣總量 111.1 ml（100 ml、10 ml、1 ml、0.1 ml 各 1 份）

表 3　大腸菌群檢數表
接種水樣總量 11.11 ml（10 ml、1 ml、0.1 ml、0.01 ml 各 1 份）