外泌體和微囊泡：使用NTA技術測定濃度、粒徑大小和表型

簡介

人們的關注點更多地集中在微囊泡和外泌體，因為它們正越來越多的被引用為一個潛在的生物標記。 雖然在這一新興領域內的定義還不夠正式，但這兩類生物納米顆粒都可以通過其粒度范圍和生物起源加以區分。 通常，微泡的直徑為100 nm至1 μm，而外泌體的直徑為30 nm - 100 nm。 微泡一般是通過細胞質膜起泡形成的，而外泌體則通過核內體的多泡體胞吐作用釋放出來。 兩者似乎均參與細胞信號傳導，可攜帶一系列信號傳導蛋白以及信使RNA和微microRNA分子 兩者在血液中的循環水平在眾多疾病中都表現為增高，其中包括動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病、血液病和炎癥性疾病、糖尿病以及癌癥。

目前，外泌體的研究一直因缺乏合適的表征測試方法而受到限制。 馬爾文的NanoSight系列產品采用獨一無二的成熟技術而使這一需求得到滿足。 納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術允許實時地對懸浮液中50 nm - 1000 nm直徑范圍內特定的外泌體和微囊泡進行逐個的直接成像和觀察。 同時，NTA可提供高分辨率的粒度分布圖表和濃度信息。 該技術易用、快速、穩健、準確且使用成本低，是對現有方法的一個良好補充。 在熒光模式下通過一系列不同激發波長的激光，可以對樣本中的已經被標記的顆粒進行表征的測定和鑒別。

檢測和測定細胞外囊泡的濃度

動態光散射（DLS）和NTA都可以通過斯托克斯-愛因斯坦方程式測定運動速度或擴散系數（Dt）與粒度有關的納米顆粒的布朗運動。

使用NTA時，激光照射懸浮液中的顆粒，并用視頻攝像機捕獲所產生的散射光。 通過跟蹤單個顆粒在二維平面上的位置變化來確定顆粒的擴散情況。 如果擴散系數（Dt）已知，就可以確定顆粒的流體力學直徑。

下圖顯示出顆粒在溶液中進行布朗運動的情況。 初步目視檢查表明，存在較大顆粒或聚集物（圖1A）。 然后，NTA軟件快速生成逐個顆粒的高分辨率粒度分布以及所觀察到囊泡顆粒的計數（依據絕對計數濃度）（圖1B）。

圖1* 稀釋的無血小板血漿樣品 A） NanoSight技術生成的典型圖像 所生成的圖像讓用戶能夠立即識別其樣品的某些特性（包括濃度和多分散性水平）。 B） 樣品的粒度分布與原始濃度計算值 *結果來源：C Gardiner¹, R Dragovic¹, A Brooks¹, D Tannetta¹, D Redman², P Harrison², and I Sargent¹（2010） Nanoparticle Tracking Analysis for the Measurement and Characterisation of Cellular Microvesicles and Nanovesicles, Proc NVTH BSTH 2010.
¹Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford
²Oxford Haemophilia & Thrombosis Centre, Churchill Hospital , Oxford, UK

替代技術

傳統上，許多技術已被用來表征微米和納米囊泡，同時有更多技術可用來分析微型顆粒。 其中包括：

• 流式細胞計數法

• 動態光散射（DLS）

• 電子顯微鏡檢查法（EM）

• 酶聯免疫吸附分析（ELISA）

上述技術中應用最廣泛的是流式細胞計數法。 通常，商用流式細胞儀的實際粒度下限約為300 nm（對于聚苯乙烯顆粒）；在該數值下，信號無法與基線噪音區分開來。 雖然通過使用熒光標記可以擴展該檢測限值，但粒度較小時，準確測定這類顆粒大小的能力嚴重受限。 DLS也已用于此項應用，并可為單分散樣品提供精確的粒度信息。 NTA可以為需要高分辨率粒度分布的DLS提供其他正交信息。 電子顯微鏡檢查法是一種非常有用的微米和納米囊泡研究工具，但其代價是資金運行成本高、樣品制備昂貴、處理時間長以及樣品制備后的樣品完整性差。

測定項目的可選擇性

雖然它通常足以確定樣品中是否存在某一粒度或粒度范圍的顆粒，但它還具有鑒別和區分樣品內特定的亞群落顆粒的附加價值。 NanoSight技術能夠借助類似抗體介導型熒光標記等方法，選擇性地分析這類群落。 這種方法使得用戶可以只選擇檢測和分析結合有熒光標記型抗體的特異性納米顆粒，而非特異性背景顆粒則通過使用適當的濾光器而被排除。 雖然可以使用一系列熒光團，但使用高效、高穩定性的量子點標記更具優勢，可以取得最佳效果。

該技術如圖2A所示，通過裝有藍紫色激光二極管（405 nm）的NanoSight 儀器激發的量子點的一個視頻幀的熒光信號。 這些量子點用來標記對合胞體滋養層微泡（STBM）上的目標生物標記具有特異性的一種抗體（NDOG II）。

圖2B顯示出三種粒度分布，其中包括： i） （非熒光）光散射器檢測到的STBM樣品中的所有顆粒（藍線）； ii） 在熒光模式下測定的結合有熒光量子點標記 NDOG II抗體的顆粒（紅線）；和 iii） 一種對照品（綠線），由一個類似的量子點標記抗體組成，但抗體對STBM上的目標生物標記沒有親和力（同樣在熒光模式下測定）。 這說明，樣品中的大多數顆粒都成功使用STBM特異性量子點NDOG II抗體進行了特異性標記，并且對照品也成功顯示出超低的背景信號。

圖2* A） 借助抗體與STBM顆粒相結合的量子點所得出的熒光圖像 B） 來自散射光（藍色）、正確抗體（紅色）和非正確（對照）抗體（綠色）的粒度分布 請注意計數濃度縱軸。

結論

NTA能夠對低濃度的微囊泡和外泌體進行大小和濃度測定，并且在與熒光標記聯合使用時，可以選擇性地確定和分析復雜樣品中特定類型的顆粒。