基因表達輪廓（geneexpressedprofile）技術2

經過這輪ＲＤＡ過程,Tester中的目的DNA將得到第一次富集。將第一輪產物更換新接頭,進行第二輪RDA過程,目的DNA可得到進一步的富集。該技術假陽性很低。但仍不能解決個體mRNA在豐度上存在巨大差異的問題,當靶序列濃度較低時,其富集受抑制。

3：抑制消減雜交（suppression subtractive hybridization,SSH）技術
是Diatchenko于1996年建立的另一種應用PCR方法的消減雜交技術.該技術是反轉合成testercDNA和drivercDNA, RsaⅠ或HaeⅢ酶切成為短片段T和D,將T分為兩份加不同的接頭1（A1）和2(A2)(均為44/10 bp5’脫磷雙鏈，5’脫P可保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA的5’-末端連接，分別具有一段反向末端重復序列，具體序列見實驗),將T1和T2分別與過量的D雜交,第一輪雜交后,兩組雜交產物混合,將這些產物再與D進行第二輪雜交,產生如下雜交體：T1/T2;T1/T1;T2/T2;T1/D;T2/D;D/D。雜交產物補平后作為模板,用A1和A2作為引物進行PCR擴增。在上述雜交體中T1/T2雙鏈兩端帶有不同接頭序列，因此可以指數擴增；T1/D和T2/D因只有一個引物配對序列所以只能線形擴增，而T1/T1和T2/T2盡管雙鏈兩端均帶有接頭，但由于其雙鏈帶的接頭為同類，在末端補平后形成長反向重復序列，并且鏈內退火優于鏈間退火，因此在退火時產生“鍋柄樣”結構，無法與引物配對，不能擴增（此即為抑制PCR）；而D/D因沒有引物配對序列則無法擴增，因此經過兩次雜交及PCR后只有T1/T2復合體才能得到擴增。這樣僅在目標樣品中表達而在驅動樣品中不表達的基因轉錄產物被差顯。

SSH與cDNA-RDA相比除具有假陽性低，穩定性好的共性外，還解決了mRNA豐度差異的問題。SSH均衡了不同mRNA的豐度。對于豐度高的mRNA,經第二次雜交后很多將形成T1/T1或T2/T2雜交體，其形成T1/T2雜交體的頻率與低豐度的mRNA形成的T1/T2雜交體差異不大。但SSH要求mRNA量過高，雜交時間過長，這些是該技術的缺陷。

4：基因表達系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE ）
是Velculescu等于1995年建立了一種快速而高效地分析組織或細胞基因表達狀態的方法。SAGE技術不僅能夠全面地分析特定組織或細胞表達的基因并得到這些基因表達豐度的數量信息,而且還可比較不同細胞、組織、器官基因表達差異；不同發育階段、不同時空、不同條件下基因表達差異；及非遺傳多型性形成中基因表達的差異。SAGE是一種以序列分析為基礎的分析基因表達差異的方法，其原理包括兩個方面:(1)一個很短的核苷酸序列標簽(9－11bp)就包含了足以區別單一轉錄本的信息。例如9個bp的序列即可區別262144(49)個轉錄本。(2)通過將短的序列標簽鏈接起來即可以在一個克隆中對多個標簽進行連續的測序分析。其實驗路線主要包括:(1)以生物素化的poly(T)為引物反轉錄合成cDNA, 限制性內切酶（anchoring enzyme,AE,,錨定酶，專一性作用4堿基 CATG）切割cDNA，釋放5′序列，鏈酶抗生物素蛋白磁珠吸附cDNA的3’端部分。(2)將cDNA分成兩份,連接含有Ⅱ類限制性內切酶(標簽酶,Tagging enzyme,TE如BsmFI)酶切位點的接頭序列A、B。Ⅱ類限制性內切酶。(3)用標簽酶消化(TE在距識別位點20bp處切割DNA雙鏈, 釋放帶有接頭的SAGE標簽（接有接頭的cDNA片段）,(4)帶有接頭的SAGE標簽經Klenow等DNA聚合酶補平后, 2個cDNA池的片段混合連接，形成帶有兩個接頭的雙標簽(ditag),用引物A、B進行PCR擴增。(5)錨定酶切割去除引物A、B,得到位于兩個錨定酶酶切位點之間的雙標簽序列,利用其兩端的粘性末端,雙標簽序列之間互相鏈接, 形成長短不一的多聯體，電泳分離后收集大小適中的片段克隆到載體中，測序，SAGE軟件分析得到標簽序列，以確定轉錄本的出現與否以及出現頻率并登錄GenBank、dbEST、SAGEmap數據庫，進行比較，獲取相關信息。

5:表達序列標簽(expressed sequence tag ,EST)
是Venter.J.Cadams及Adams等于1991年提出。EST是從cDNA文庫中隨機挑取的cDNA克隆的外源插入片段的一端或兩端進行一次性測序(Single-runsequencing)產生的DNA序列。每一個EST代表一個表達基因的部分轉錄片段,能說明該組織中各基因的表達水平。EST在數據庫中其長度一般從20到7000ｂｐ不等,平均長度為60±120ｂｐ。EST的總體步驟為總mRNA提取，cDNA文庫構建，隨機挑取cDNA克隆，測序，數據庫比對，電子雜交和電子延伸。EST目前主要用于構建基因圖譜、充當探針、進行定位克隆并尋找新的基因、作為一種新的分子標記或新的SSR標記來源、用于研究生物群體多態性、進行功能基因的研究、進行基因表達信息及表達差異分析。

EST研究中所需的數據庫主要為 National Center of Biotechnology Information,NCBI GenBank (http://www.nchi.nlm.nih.gov/web/GenBank/imdex. Html)； European Molecular Biology Laboratory European Bioinformatics Institute,EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/databases/index.html)；DNA Data Bank of Japan,DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)我國生物信息中心CBI(http://www.chi.pku.edu.cn)；美國Brookhaven國家實驗室蛋白質結構數據庫(PDB)；適于核酸序列查詢的BLASTN、BLASTX、TBLASTX(主要用于EST分析)和適于蛋白質序列查詢的BLASTN、BLASTP數據庫;及DBEST(DatabaseEST,集成了Genbank、EMBL-EBI、DDBJ、PDB的非冗余的EST數據庫);Nr(集成瑞士蛋白質數據庫(SWISS-PROT)、蛋白質信息資源數據庫(PIR)、日本蛋白質研究基金會蛋白質數據庫(PRF)以及從Genbank序列編碼區中的蛋白質和PDB中擁有原子座標的蛋白質的非冗余蛋白質數據庫, 是一個非冗余DNA數據庫)。