實驗材料 幼胚盾片
試劑、試劑盒 乙醇漂白消毒劑
儀器、耗材 誘導培養基
實驗步驟
下面介紹的是經過優化的針對幼胚盾片轉化的方法,幼穗可以代替幼胚盾片使用。對某些特定的品種,幼穗轉化比幼胚盾片轉化更有效,如普通小麥品種 T.aestivum vars. Baldus 和 Brigadier,以及其他小麥亞族 Triticeae;硬粒小麥品種 T.turgidum ssp 和小大麥(見注 23 和注 24 )。
1. 收集和消毒小麥穎果
( 1 ) 收集溫室生長 10~12 周的小麥穗(見注 25 ) 。
( 2 ) 從穗中剝出穎果(見注 26)。
( 3 ) 用 70% 乙醇將小麥穎果滅菌 5 min,然后用 10% 漂白消毒劑浸泡 15~20 min,中間晃動幾次。
( 4 ) 用滅菌水至少洗三次。保持滅菌后穎果的濕度,但是不要浸泡在水中。
2. 分離和預培養幼胚盾片
( 1 ) 在無菌環境中,顯微鏡下分離幼胚 [ 圖 4 .1 ( a ) ] 并且切除胚軸以防止萌發(見注 2 7 )。
( 2 ) 將 25~30 個盾片放置在包含誘導培養基(MS9% 0.5 DAg)、直徑 9 cm 的培養皿的中間區域,將胚的切面放置在培養基上,即完整的盾片作為轟擊面 [見注 28 , 圖 4.1 (b ) ]。
( 3 ) 使用封口膜 Nescofilm (Fisher Scientific UK) 封好平板,轟擊前將培養皿放在 22℃ 黑暗條件下預培養 1~2 天(見注 29) 。