基因工程的載體和工具酶應用結合案例

第一節 載體

引 言

基因克隆的本質是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達，而目的基因本身無法進行復制和表達、不易進入受體細胞、不能穩定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細胞”來實現。

作為基因克隆的載體必須具備以下特性：

⑴載體必須是復制子。

⑵具有合適的篩選標記，便于重組子的篩選。

⑶具備多克隆位點（MCS），便于外源基因插入。

⑷自身分子量較小，拷貝數高。

⑸在宿主細胞內穩定性高。

一、質粒載體

（一）質粒的生物學特性

（1）質粒是獨立于染色體以外的能自主復制的裸露的雙鏈環狀(少數為線形和RNA） DNA分子。

廣泛從在于細菌細胞中，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發現了質粒，目前對細菌的質粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質粒。大腸桿菌的質粒主要有F質粒（F因子）、R質粒（抗藥性因子）和Col質粒（大腸桿菌素因子）三種。

（2）質粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質分子，最大的達到200kb。

（3）質粒的生存在寄主細胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復制；同時質粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復制起點不一定能在其它生物細胞中繁殖。

（4）質粒的復制類型一種質粒在宿主細胞中存在的數目稱為該質粒的拷貝數。據拷貝數將質粒分為兩種復制型：“嚴緊型”質粒（stigent plasmid）,拷貝數為1-3；“松弛型”質粒（relaxed plasmid）,拷貝數為10-60。不過即使是同一質粒，其拷貝數在不同的寄主細胞間和不同的生長環境也可能有很大的變化。

（5）質粒的不親和性 兩種親緣關系密切的不同質粒不能在同一宿主細胞中穩定共存。載體質粒與受體的質粒應是不同的不親和群。

（6）質粒的轉移

轉移性質粒，含有tra基因；能通過結合作用從一個細胞轉移到另一個細胞。

非轉移性質粒，不含tra基因；可以為轉移性質粒所帶動轉移。

（7）質粒的存在形式有超螺旋、開環雙螺旋和線狀雙螺旋三種。

（二）質粒DNA的制備

有多種分離質粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法等。

目前一般使用堿變性法制備質粒DNA。這個方法主要包括培養收集細菌菌體，裂解細胞，將質粒DNA與染色體DNA分開及除去蛋白質和RNA。

1.堿變性法質粒提取的原理：

根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓撲學上的差異而發展出來的。

在pH值12.0～12.5范圍內時，線性的DNA會被變性而共價閉合環狀質粒DNA卻不會被變性。

通過冷卻或恢復中性pH值使之復性，線性染色體形成網狀結構，而cccDNA可以準確迅速復性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質粒DNA。

2.堿變性法提取質粒的步驟：

（1）取1.5毫升含質粒的大腸桿菌過夜培養物，加在微量離心管中，離心收集細胞沉淀；

（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）渦旋震蕩懸浮菌液。

（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。

（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸鉀29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫升）顛倒離心管10次后，冰浴5分鐘。

（5）離心的上清液用苯酚抽提數次，用乙醇沉淀收集質粒DNA。

（三）質粒載體的改造

⑴去掉不必要的DNA區段。

⑵減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。

⑶加入易于撿出的選擇性標記基因。

⑷對質粒進行安全性改造，要求質粒不能隨便 轉移。

⑸改造或增加基因表達的調控序列。

1、質粒pBR322

結構：

（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）

內部有3種限制酶單一識別位點 。

（2）四環素抗性基因（tetr或Tcr）

內部有7種，啟動區內有2種限制酶單一識別位點 。

（3）DNA復制起點（ori）

pBR322質粒的優點：

（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。

（3）具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后,每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。

（4）對多種常見的限制性內切核酸酶只含有一個能切割的位點。

2、pUC質粒載體

1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術在pBR322基礎上構建的。

結構：

（1）來自于pBR322的Ori

（2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發生了變化

（3） LacZ′基因

編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈即氨基末端。

（4）MCS區段

是一段用于插入外源DNA片段的特定區域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成，而且每個限制性內切酶位點在整個載體中是唯一的。

與pBR322相比， pUC質粒載體優點：

（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數

如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp，控制質粒復制rop基因的缺失，平均每個細胞即可達500～700個拷貝

（2）適用于組織化學法檢測重組體

通過a-互補作用，利用菌落顏色篩選重組子。

（3）具有多克隆位點區段（MCS）

可以定向克隆防止載體自我連接。

二、噬菌體載體

（一）l噬菌體載體

1. 噬菌體的生物學特性

烈性噬菌體：只具有溶菌生長周期

溫和噬菌體：具有溶源生長周期和溶菌生長周期

溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環化，然后進行自我復制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。

溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。

整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌被稱為溶源性細菌。在溶源性細菌內存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。

2. l噬菌體的生物學特性

⑴組成：蛋白質外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。

lDNA長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區被稱為cos位點（cohesive end site）.

⑵是一個溫和噬菌體

一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。

⑶復制

溶源周期隨溶源細菌染色體一起復制

溶菌周期的早期是“θ”復制，晚期進行滾環復制

⑷基因組成

lDNA至少包括61個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約1／3為非必須區段。

3. l噬菌體載體的類型

插入型 （Insertion vectors ）

這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。

如：λgt10 、 λgt11

克隆能力小，不到10kb

置換型 （Replacement vectors）

這種載體具有兩個對應的酶切克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。

如Charon 4 載體

克隆能力大，20～25kb

（二）M13噬菌體

1、絲狀噬菌體M13噬菌體的生物學特性

⑴是單鏈閉合環狀噬菌體

只能感染雄性細菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個區和507 bp基因間隔區（IS區），該區可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。

⑵復制與增殖（圖）

2. M13噬菌體載體的構建

⑴ 在IS區內插入LacZ基因 ⑵在標記基因區內組裝MCS區段

所以能通過a互補在X-Gal/ IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等

這類載體的突出優點在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表現不穩定，在噬菌體增殖過程中容易發生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內，克隆300-400bp的片段十分穩定。

（三）柯斯質粒載體

1.柯斯質粒載體的特點

柯斯質粒是一類人工構建的含有lDNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體，cosmid是cos site carrying plasmid的縮寫。

柯斯質粒的大小為4-6kb，

由3部分組成：

A.多克隆位點區

B. 含有cos位點的lDNA區

C. 復制起始位點和抗性標記區

2.柯斯質粒載體的特性

1、具有l噬菌體的特性 柯斯質粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉導寄主細胞。進入寄主細胞的DNA也能環化和復制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發生溶菌現象。

2、具有質粒載體的特性 能象質粒一樣在寄主細胞內復制，且帶有抗性選擇標記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。

3、高容量的克隆能力 cos質粒本身很小，只有復制起點、選擇標記和cos位點等構成，所以其克隆上限可達45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達到30kb。

四種常用載體的比較

一、 限制性核酸內切酶及其應用

（一）限制性核酸內切酶的發現

當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。

最早分離出的限制內切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒有實用價值。

首個II型限制內切酶是在1970年，由H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。

從此，相關研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內切酶中，其中有30%是在NEB發現的 。

限制性核酸內切酶（restriction endonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。切開的是3，5－磷酸二酯鍵。

（二）限制性核酸內切酶的分類

分為I型、II型和III型。

（三）限制性核酸內切酶的命名

1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體

字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；

2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；

3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數字標出，比如Eco R I、 Hind III。

（四） II型限制性核酸內切酶的基本特性

1、識別位點的特異性

每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4～8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

2、識別序列的對稱性

靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。

3、切割位點的規范性

交錯切或對稱切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

與II型核酸內切酶有關的幾個概念

粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。

平 末 端 ：Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產生的平齊末端結構。則不易于重新環化。

同裂酶：isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。

同尾酶：isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一組同尾酶。

注 意： 由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。

（五）限制性核酸內切酶的消化反應

一個限制酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37℃）下，1h內中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。

影響酶活性的因素很多，最重要的有：

⑴　DNA的純度

⑵　 DNA的甲基化程度

⑶　酶切反應的溫度（通常為37℃ ）

⑷　DNA的分子結構

⑸　 核酸內切限制酶的緩沖液

在“非最適的”反應條件下,有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現象叫星號活性。用*表示。

二、 DNA連接酶及其應用

（一）DNA連接酶的發現

環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。

首個DNA連接酶(ligase)——大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發現的，是大腸桿菌基因編碼。

1970年，發現了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。

（二） DNA連接酶作用特點

1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’－OH和5’－P，而且這兩個基團彼此相鄰；

2. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。

E.coli DNA連接酶 －連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。

T 4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。

（三） DNA連接酶的反應條件

影響連接效率的因素有：

1. 溫度（通常在4-15℃ ）

2. ATP的濃度(10μM／L - 1mM／L )

3. 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，黏性末端僅需0.1U）

4. 反應時間（通常連接過夜）

5. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）

（四）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案

1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。

2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1～5∶1），補足ddH2O 至8μl。

3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl，稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃）連接8-14hr。

三、DNA聚合酶及其應用

（一）大腸桿菌DNA聚合酶I

是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：

5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
從游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。

大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途

1.利用缺口轉移法制備高比活度的DNA探針

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

2.用于DNA連接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。

3.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

（二）Klenow片段酶

Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生的大片段酶分子，分子量為76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

　　　　　⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：

⑴修補限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端

⑵標記DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成

⑷DNA序列的測定

（三）T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強100～1,000倍。

因此，可以綜合利用這兩種活性進行取代合成反應：

如果反應體系中僅存在一種dNTP或沒有底物時，這時T4DNA聚合酶就會表現出3 ′→ 5 ′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出底物dNTP相同的堿基。然后就在此位置發生合成和取代反應。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反應制備探針

(2)標記具有平末端的或具有3’－隱蔽末端的DNA片段

利用較強的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

（四）逆轉錄酶（反轉錄酶）

逆轉錄酶 是一種依賴RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發現的。這兩個課題組的論文都發在了同一期的《Nature》雜志上。

最普遍使用的是從鳥類骨髓母細胞瘤病毒（AMV）分離出來的。

活性：一種可以有效地將mRNA反轉錄成DNA的酶，其產物稱為cDNA(complementary DNA).

主要用途是 將mRNA轉錄成cDNA以制備基因片段。

四、修飾性工具酶

（一）末端轉移酶（terminal transferase）

l 末端轉移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。

l 特性：該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有用。

l 最常見的用途：給外源DNA片段及載體分子加上互補的同聚物尾巴，以創造黏性末端，便于重組。

（二） SI核酸酶（SI nuclease）

這是一種從米曲霉（Aspergillus oryzae）中分離的高度單鏈特異的外切酶。

活性：可以降解單鏈DNA或RNA或雙鏈的單鏈區。

其主要用途有：

1. 在cDNA合成過程中，切開cDNA的發夾末端；

2. 載體構建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，

形成平末端結構。

（三）堿性磷酸酶

從大腸桿菌中分離的細菌堿性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）簡稱BAP。

從小牛腸中分離的叫小牛腸堿性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，簡稱CIP，用的廣泛。

酶催功能：

脫磷酸作用，將單鏈或雙鏈DNA或RNA5’－P轉化成5’－OH。

其主要用途有：

⑴在用32P標記DNA 5′端之前，去除5′端的磷；

⑵在DNA重組技術中，去除DNA片段的5′磷酸，防止載體的自身環化，提高重組子比例。