基于AFLP的轉錄表達譜分析

Total RNA

鏈霉親和素包被的磁珠洗滌緩沖液EDTA第一鏈緩沖液第二鏈緩沖液DTT4 dNTP 的混合物SuperScript IIRNase HSTEXTris· ClRL緩沖液ATPPCR 緩沖液T4 多核苷酸激酶緩沖液加樣染料硅烷黏合硅烷溶液變性聚丙烯酰胺凝膠TBE 分子質量標準物乙酸

微量離心管磁座PE-9600 熱循環儀PCR 板測序凝膠系統磷屏

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 在一個無 RNase 的微量離心管里混合 200 ug 總RNA、600 ng 5'-生物素化的 oligo-dT₂₅ （5-生物素-dT₂₅）和 300 ul 2× 結合緩沖液。用水調整體積到 600 ul。70°C 加熱 5 min， 隨后室溫放置 15～20 min。

2. 用 0.5 ml 的 1× 結合緩沖液洗滌 150 ul 的鏈霉親和素包被的磁珠（見下面步驟 4 關于技術和微量離心管的使用）。磁珠重懸于 50 ul 同樣的緩沖液中。

3. 把這些洗過的磁珠，加入含 RNA 的混合物里（步驟 1）室溫下輕輕攪動，溫育 30 min。

4. 把微量離心管放在磁座上 30 s，然后吸掉盡可能多的上清，不要攪動磁珠或讓它們干掉。把管子從磁座上拿下來，加入 0.5 ml 洗滌緩沖液，徹底混勻。重復 2 次以上，最后一次洗后吸掉上清。

5. 把磁珠重懸在 20 ul 12 mmol/L EDTA 中，70°C 加熱 5 min 洗脫 poly （A）⁺ RNA。按步驟 4 用磁座收集磁珠，盡可能快地轉移上清到一個新的無 RNase 的微量離心管里，不要吸取任何磁珠。重復一次，總共得到約 40 poly （A）⁺ RNA。 如果長期保存，加入 0.1 倍體積的 2 mol/L， pH 5.5 的乙酸鈉，混勻，加入 3 倍體積的 100％ 乙醇，可以無限期地保存于 -20°C。回收時，最高速離心 5 min， 棄掉上清，在旋轉蒸發儀上晾干，用雙蒸水或緩沖液重懸到原來的體積。

6. 用 5 ul poly （A）⁺ RNA 溶液連同分子質量參照物一起進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查分離的 poly （A）⁺ RNA 的產量（平均約 2 ug）和質量。電泳應該在大約 10 kb 以下出現很弱的拖尾（低分子質量）夾雜極少量的 rRNA。

7. 混合以下反應液，合成第一鏈 cDNA：

10 ul poly （A）⁺ RNA（約 0.5 ug）

0.5 ul 700 ng/ul 5-生物素-dT₂₅（逆轉錄引物）

2 ul H₂O

4 ul 5× 第一鏈緩沖液

2 ul 0.1 mol/L DTT

1 ul 10 mmol/L dNTP

0.5 ul 200 U/ul 的 SuperSript II （最后加）

42°C 溫育 2 h。

8. 混合以下反應物，進行第二鏈合成：

20 ul 第一鏈 cDNA 合成混合物（來自步驟7）

16 ul 5× 第二鏈緩沖液

1.5 ul 10 mmol/L dNTP

3 ul 0.1 mol/L DTT

7.5 U E.coli DNA 連接酶

25 U E.coli DNA 聚合酶 I

0.8 U RNaseH

加水到 80 ul。

12°C 溫育 1 h，然后 22°C 再溫育 1 h。用瓊脂糖凝膠檢查 cDNA 的質量和產量。

9. 用 100 ml 的 2×STEX （技術方面見步驟 4）洗滌 25× 鏈霉親和素包被的磁珠。重懸在 80 ul 的 2×STEX 中。

10. 把磁珠懸液加入 cDNA 混合物里，室溫輕輕攪動，溫育 30 min。

11. 用磁座收集磁珠（步驟4），用 100 ul 的 1×STEX 洗一次，轉移到一個新的微量離心管里。用 1×STEX 再洗兩次，最后把磁珠重懸在 50 ul 的 H₂O 或 10 mmol/L的 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA。

12. 混合下面的反應物：

20 ul cDNA 樣本（一般 100～200 ng）

10 U TaqI 限制性內切核酸酶

8 ul 5×RL緩沖液

用水調整體積到 40 ul。

65°C 保溫 1 h。

13. 加入如下成分：

10 U MseI 限制性內切核酸酶

2 ul 5× RL 緩沖液

用水調整體積到 50 ul。

37°C 溫育 1 h。

14. 混合 8.5 （1500 pmol） 的長鏈和 8 （1500 pmol）短鏈用于制備Taql接頭。用水調整體積到30 ul。

15. 混合 8.5 ug（1500 pmol）的長鏈和 8 ug （1500 pmol）短鏈用于制備 TaqI 接頭。用水調整體積到 30 ul。

16. 用 TagI 和 MseI 消化的 cDNA 片段（步驟 12、13）中加入下述試劑：

1 ul 各種接頭（各 50 pmol； 步驟 14、15）

1 ul 10 mmol/L ATP

2 ul 5× RL 緩沖液

10 ul H₂O

37°C 溫育 1 h。加入 1 U T4 DNA 連接酶，37°C溫育 2 h。

17. 用 Tris-HCl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 10 倍稀釋一小份（2～5 ul）模板混合物（步驟16)。準備如下擴增反應：

5.0 ul 1：10稀釋的模板混合物

1.5 ul 各 8 pmol/ul 的 AFLP＋0 （非選擇性）引物

2.0 ul 5 mmol/L dNTP （每種 dNTP 的終濃度為 0.2 mmol/L）

5 ul 10× PCR緩沖液

1 U Ampli Taq DNA 聚合酶

加水到 50 ul。

18. 在 PE-9600 熱循環儀上運行下面的溫度循環進行擴增：

20 輪：

30 s 94°C（變性）

60 s 65°C（引物復性）

60 s 72°C （引物延伸）。

19. 取 10 ml 反應混合物和分子質量參照物一起電泳，檢查預擴增的情況。 應該看到位于 50～500 bp 之間的，呈拖尾狀的彌散產物。

20. 按 1：500 稀釋 2 ul 非選擇性的預擴增cDNA片段（也就是＋0/＋0）到Tris· Cl （pH 8. 0）/0.1 mmol/L EDTA。

21. 在一個適合于 PE-9600 的熱循環儀的 PCR 板上準備選擇性預擴增反應（＋1/＋1）：

21.1 分裝 5 ul 1：500 的非選擇性預擴增 cDNA 片段到 PCR 板上的前兩列（1和2）的每一個孔中。

21.2 分裝 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 T 叫 TaqⅠ+A 到 A1 至 D1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+C 到 E1 至 H1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ＋G 到 A2 至 D2 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+T 到 E2 至 H2 的孔中。

21.3 分裝 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋A 到 A1、A2、E1 和 E2 中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋C 到 B1、B2、F1 和 F2 中，1.65 ul 的 8 pmol/ul 的引 物 MseI＋G 到 C1、C2、D1 和 D2 中，1.4 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseI＋T 到 D1、D2、H1 和 H2 中。

21.4 混合 32 ul 5 mmol/L dNTP， 80 ul 的 10× PCR 緩沖液 ，16 U 的 AmpliTaq-Gold 聚合酶，用水調整體積到 672 ul，配制成 dNTP/聚合酶混合液。

21.5 分裝 42 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前兩列的每個孔中。

22. 運行下面的降落： 溫度循環程序進行 AFLP 擴增：

13 輪：

30 s 94°C（變性）

30 s 65°C- 0.7°C/輪（引物復性）

60 s 72 0C （引物延伸）

20 輪：

30 s 94°C（變性）

30 s 56°C（引物復性）

60 s 72°C（引物延伸）

23. 準備下面的磷酸化反應混合物：

2.0 ul 10 uCi/ul （約 2000 Ci/mmol） ［³³P-γ］ ATP

1.0 ul 10× T4 多核苷酸激酶緩沖液

4 U T4多核苷酸激酶

加水到 8 ul。

24. 混合 2.0 ul 8 pmol/ul 的選擇性引物（＋2）和 8 ul 的磷酸化反應混合物（步驟 23），磷酸化 16 pmol的選擇性 TaqI＋2 引物（20 個 AFLP 反應所需的量；也就是，對一個給定的 TagI＋2 引物，整套 256 種引物組合種所有 16＋2/＋2 的反應所需的量），產出的標記引物濃度為 12.6 pmol/ul， 終體積 10 ul。37°C 溫育 60 min，隨后 70°C 加熱 10 min 失活激酶。

25. 把 2 ul 各個預擴增產物（＋1/＋1；22 步）用 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 稀釋 500 倍。在一個適合于 PE-9600 的熱循環儀的 PCR 板上準備選擇性擴增反應（＋2/＋2）：

25.1 分裝 2 ul 1：500 的預擴增混合液 TaqI＋A/MseI＋C 到 PCR 板上的前兩列。

25.2 分裝 0.5 ul 標記的引物：TaqI＋AA 到 A1 至 D1 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AC 到 E1 至 H1 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AG 到 A2 至 D2 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AT 到 E2 至 H2 的孔中。

25.3 分裝 0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CA 到 A1、A2、E1 和 E2 孔中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CC 到 B1、B2、F1 和 F2 孔中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CG 到 C1、C2、D1 和 D2 中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CT 到 D1、D2、H1 和 H2 中。

25.4 混合 12.8 ul 5 mmol/L dNTP， 32 ul 的 10×PCR 緩沖液，6.4 U 的 AmpliTaq- Gold 聚合酶，用水調整體積到 270.4 ul， 配制成 dNTP/聚合酶混合液。

25.5 分裝 16.9 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前兩列的每個孔中。

26. 按照步驟 22 中的「降落」 PCR 程序擴增產物。

27. AFLP 反應中加入等體積（20 ul）的上樣緩沖液。90°C 加熱 3 min 變性 AFLP 反應產物，然后快速置于冰上冷卻。

28. 測序凝膠系統的后玻璃板用 2 ml 排斥型硅烷處理，前玻璃板用 10 ml 的黏合型硅烷處理。準備 4.5％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠（約 100 ml）。

29. 用 1×TBE 作電泳緩沖液，上樣前預電泳 0.5 h， 使用合適的電泳條件使凝膠加熱到約 55°C （如對 BioRd 系統固定 110 W）。用溫度計監測凝膠的溫度。

30. 每孔上樣 3 ul（48 道的凝膠）或 1.5 ul（96 道的凝膠）的樣品，約 55°C 電泳分析。 如果需要的話，加上一個分子質量參照物（如 SequalMark 10-base 序列階梯）。

31. 電泳完成后，卸下凝膠。因為硅膠的處理，凝膠會黏附在前板上。凝膠浸泡在 10％ 的乙酸里 30 min 以固定凝膠。用水徹底淋洗凝膠，在通風櫥里室溫干燥 10～21 h， 或使用較高溫度 （如使用溫度浴）干燥較短時間直到凝膠不再發黏。

32. 放射自顯影或用磷屏顯示凝膠分離的 cDNA 片段。

1. 所有接觸RNA的溶液和材料必須是無RNase的，RNA的操作必須使用正確的操作技術。

2. 供應商和品牌一般不是十分重要，然而當遇到問題的時候，建議至少使用推薦商標的逆轉錄酶（SuperScript II）和 Taq 聚合酶（AmpliTaq 和 AmpliTaq-Gold）。

3. 當準備 AFLP 擴增的時候，建議盡可能使用混合好的試劑混合液。使用試劑混合液有助于配制反應，也非常有助于結果的可信度和重復性。在實際操作中，混合液的配制因實驗而定，即確定哪一個成分在一系列反應中是不變的：模板還是引物的組合（例如，一個樣品和許多不同的引物組合，許多樣品和一個引物組合）。

4. 甲酰胺是有害的，在通風櫥里進行這一步操作。

5. 放射性物質需要特殊的操作。

1. 材料

Total RNA

2. 試劑

5' 生物素化的 dT₂₅（5-生物素-dT₂₅）

1× 和 2× 結合緩沖液 H₂O： Milli-Q 純化的水（也就是經過五級Milli-QPhis系統處理的去離子水；Milipore）或雙蒸水

鏈霉親和素包被的磁珠（Dynal）

洗滌緩沖液

2 mmol/L EDTA，pH 7.5

5× 第一鏈緩沖液

5× 第二鏈緩沖液

0.1 mol/L DTT

5 和 10 mmol/L（每個）4 dNTP 的混合物（Amersham Pharmacia Biotech)

SuperScript II （Life Technologies）

E.coli DNA 連接酶（Life Technologies）

E.coli DNA 聚合酶 I （Pharmacia Biotech）

RNase H （Pharmacia Biotech）

1× 和 2×STEX

10 mmol/L Tris· Cl，pH 8. 0/0.1 mmol/L EDTA

TagI 限制性內切核酸酶（New England Biolabs）

5×RL緩沖液

MseI 限制性內切核酸酶（New England Biolabs）

50 pmol/ul 帶 TagI 黏性末端的連接子

750 pmol/ul 帶 Msd 黏性末端的連接子

10 mmol/L ATP （Amersham Pharmacia Biotech）

T4 DNA 連接酶（Amersham Pharmacia Biotech）

8 pmol/ul AFLP＋0 （非選擇性）引物（見寡核苷酸和雙鏈連接子的說明）：TaqI＋0 和 MwI＋0 引物

10×PCR 緩沖液

Ampli Taq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer）

10 uCi/ul （約 2000 Ci/mmol）［³³P-γ］ATP （Amersham Pharmacia Biotech）

10× T4 多核苷酸激酶緩沖液

T4 多核昔酸激酶（Amersham Pharmacia Biotech）

8 pmol/ul AFLP+1 和 +2 （選擇性）引物（見寡核苷酸和雙鏈連接子的說明）： Ta9I+1 和 +2 和 MseI＋1 和＋2 引物

Ampli Taq-Gold 聚合酶

加樣染料

硅烷（Amersham Pharmacia Biotech）

黏合硅烷溶液，新配制：在 10 ml 的乙醇里混合 30 ul 的黏合硅烷（Amersham Pharmacia Biotech） 和 30 ul 冰醋酸

4.5％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠

1× TBE 分子質量標準物（如 SequalMark 10-base ladder； Reserch Genetics；可選）

10％ （V/V）乙酸

3. 耗材

微量離心管，無 RNase

磁座（MPC； Dynal）

PE-9600 熱循環儀（Perkin-Elmer）和 PCR 板

測序凝膠系統（如 BioRad 38× 50× 0.04 cm SequiGen 測序凝膠系統）

磷屏（Fujix BAS 2000，Molecular Dynamics STORM 824）